王青元，周 穎（綜述），凌 斌（審校）

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科分子實驗室，安徽省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室，合肥 230001）

乳酸桿菌，因發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸而命名。該菌廣泛存在，嗜酸性、兼性厭氧，生存最適環(huán)境為pH 5.5～6.0，但是 pH 3.0～4.5 時仍能生存，在無芽胞桿菌中其耐酸力最強。過氧化氫酶試驗和聯(lián)苯胺試驗均為陰性，吲哚試驗、硫化氫試驗、淀粉水解試驗均呈陰性。作為益生菌，乳酸桿菌在日常生活及臨床應(yīng)用較為廣泛，如生產(chǎn)酸奶、治療陰道疾病、生產(chǎn)疫苗等?，F(xiàn)就乳酸桿菌及其體外表達(dá)系統(tǒng)在臨床中的應(yīng)用綜述如下。

1 乳酸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)

1.1 培養(yǎng)條件 乳酸桿菌，營養(yǎng)要求嚴(yán)格，除碳水化合物外，需要多種氨基酸、維生素、肽等。目前實驗室一般采用的培養(yǎng)基有:MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基和番茄汁培養(yǎng)基，選擇在含有5%CO2的厭氧罐中發(fā)酵式培養(yǎng)。

1.2 表達(dá)質(zhì)粒 大多數(shù)乳酸桿菌均含有質(zhì)粒，少數(shù)還含有多種質(zhì)粒且乳酸桿菌質(zhì)粒多具有隱蔽性、遺傳穩(wěn)定性、含抗生素基因及小型質(zhì)粒拷貝數(shù)高等特點。乳酸桿菌雖然是食品級安全菌，但并不是所有的乳酸桿菌及其質(zhì)粒都適合體外表達(dá)蛋白及在臨床中應(yīng)用。目前分離及改造的乳酸桿菌質(zhì)粒按安全范圍分為食品級和非食品級，按照宿主范圍分廣宿主和窄宿主兩種［1］。食品級、宿主范圍較窄的乳酸桿菌質(zhì)粒更適合在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用，如pSUW611、pSUW711、pNZ8048、pFMN30［2-4］等。

1.3 誘導(dǎo)表達(dá)及啟動子隨著乳酸桿菌分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，已分離出了乳酸桿菌的各種表達(dá)調(diào)控元件，對乳酸桿菌基因轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控及蛋白質(zhì)分泌機制有了進(jìn)一步的了解。研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌質(zhì)粒中普遍存在兩種調(diào)控序列:一種是與基因復(fù)制起始相關(guān)的序列，另一種是控制質(zhì)?？截悢?shù)和不相容性的DNA序列。質(zhì)粒的拷貝數(shù)是由DNA非編碼序列中的重復(fù)序列和反轉(zhuǎn)錄RNA來控制的。與基因復(fù)制起始相關(guān)的序列分兩類:一類是編碼蛋白的開放閱讀框架，在乳酸桿菌中與質(zhì)粒復(fù)制相關(guān)的開放閱讀框架之間存在同源性;另一類是與調(diào)控有關(guān)的非編碼序列，包括復(fù)制相關(guān)蛋白作用的靶序列、正-負(fù)向復(fù)制起始點、缺失位點、啟動子等復(fù)制調(diào)控元件［1，5］。其中乳酸桿菌的啟動子對乳酸桿菌具有高度的選擇性，故在乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，很少使用外源性啟動子，目前已成功用于表達(dá)外源性蛋白的啟動子有 lacA、lacR、lacF、T7、xylA、lacS、nisA、nisZ、nisF、usp等，這些啟動子的誘導(dǎo)物都是食品級的，如乳糖、木糖和乳球菌素等，易于構(gòu)成食品級乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，提高乳酸桿菌工程菌株的安全性。

2 乳酸桿菌在疾病預(yù)防和治療中的應(yīng)用

乳酸桿菌是在人體內(nèi)胃腸道和泌尿生殖道中定植的正常菌群，在疾病預(yù)防、治療以及抗衰老、抗腫瘤等方面發(fā)揮重要的生理功能。

2.1 預(yù)防疾病

2.1.1 調(diào)節(jié)機體微生態(tài)平衡 乳酸桿菌作為胃腸道和泌尿生殖道中的優(yōu)勢菌群通過黏附定植和競爭性抑制及產(chǎn)生殺菌性物質(zhì)（如乳酸、過氧化氫、細(xì)菌素、生物表面活性物質(zhì)等）等維持機體內(nèi)菌群的種類、數(shù)量及比例協(xié)調(diào)，從而維持機體微生態(tài)平衡。

2.1.2 免疫功能 乳酸桿菌能夠促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫的形成，激活免疫系統(tǒng)。對于非特異性免疫系統(tǒng)，乳酸桿菌主要通過增強黏膜屏障功能、增強體內(nèi)吞噬細(xì)胞的吞噬功能、增強自然殺傷細(xì)胞的殺傷作用、刺激機體產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素2、干擾素 γ、白細(xì)胞介素12、干擾素 α、白細(xì)胞介素10等且不同的乳酸桿菌菌株產(chǎn)生的細(xì)胞因子不盡相同［6］;對于特異性免疫系統(tǒng)，乳酸桿菌能夠增強T細(xì)胞的分化、增殖能力，提高T細(xì)胞的數(shù)量。同時能夠刺激特異性免疫應(yīng)答，如增加黏膜表面和血清中IgA和IgM、IgG水平以強化體液免疫，促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的增殖和成熟，加強細(xì)胞免疫。乳酸桿菌還能減少特異性皮炎的發(fā)生，減輕變態(tài)反應(yīng)程度、調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡。此效應(yīng)是通過菌群基因組DNA刺激外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的，且與乳酸桿菌進(jìn)入機體的劑量有關(guān)［7］。

2.2 抗感染作用 乳酸桿菌在治療胃腸道、呼吸道、泌尿生殖道的感染性疾病中發(fā)揮重要作用。創(chuàng)傷、感染患者機體內(nèi)大多存在胃腸道過度炎性反應(yīng)，嚴(yán)重者可引起膿毒血癥和多器官功能障礙。Chu等［8］研究顯示，乳酸桿菌能減輕腸道炎性反應(yīng)，降低腸道內(nèi)毒素血癥。Chiba等［9］實驗證實，給予大鼠活性乳酸桿菌，增強細(xì)胞整體免疫功能，同時使鼻腔內(nèi)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素γ和腫瘤壞死因子α增多，有利于機體清除流感病毒。Graver等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧環(huán)境中生長的乳酸桿菌主要通過產(chǎn)酸來抵抗淋病奈瑟菌的感染，并不產(chǎn)生過氧化氫。研究發(fā)現(xiàn)，患有下呼吸道感染的兒童70%伴有腸道菌群紊亂，表現(xiàn)在乳酸桿菌優(yōu)勢水平下降，腸球菌增殖，尤其并發(fā)肺炎的患兒［11］。正常女性陰道內(nèi)含有多種細(xì)菌，其中乳酸桿菌占絕對優(yōu)勢，維持菌群平衡。一旦乳酸桿菌的優(yōu)勢地位丟失，各種致病菌大量繁殖是細(xì)菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎、霉菌性陰道炎發(fā)生和復(fù)發(fā)的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，陰道炎的患者口服或陰道局部應(yīng)用乳酸桿菌制劑有助于改變陰道內(nèi)環(huán)境、降低并發(fā)癥和復(fù)發(fā)率。

2.3 抗衰老作用 乳酸桿菌能減少機體有毒產(chǎn)物（組胺、酪氨、腐胺、硫化氫、吲哚、亞硝酸鹽和酚類等）的產(chǎn)生與吸收［12］，有利于臟器功能的正常發(fā)揮及衰老進(jìn)程的延緩。乳酸桿菌還可有效參與機體抗氧化反應(yīng)，提高過氧化物酶和還原型谷胱甘肽的水平。Van Nieuwenhove［13］等將乳酸桿菌應(yīng)用于肝損傷小鼠，探討其對肝內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及自然殺傷細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示，乳酸桿菌能提高脾臟內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性及還原性谷胱甘肽水平，降低丙二醛水平。

2.4 抗腫瘤作用 乳酸桿菌在維持機體菌群平衡中起重要作用，如果乳酸桿菌的數(shù)量或者活性降低會導(dǎo)致機體微生態(tài)平衡被打破，致病菌群會大量繁殖。致病菌產(chǎn)生的代謝物質(zhì)會促使機體內(nèi)的癌前體物質(zhì)向致癌物質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而誘發(fā)癌變。乳酸桿菌能夠恢復(fù)腸道菌群平衡，拮抗腸道中病原菌生長，使細(xì)菌酶的產(chǎn)生及活性降低，還可結(jié)合致癌物質(zhì)隨糞便排出，減少了其形成、活化及滯留的機會。研究報道乳酸桿菌能夠防止幽門螺桿菌的感染并有一定的治療作用，因而間接地降低了胃癌的發(fā)病率。大量動物實驗表明，乳酸桿菌能夠抑制Lewis肺癌、ethA纖維瘤、B16黑素瘤、膀胱癌、淋巴瘤等多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)［14］。

乳酸桿菌可激活機體免疫系統(tǒng)，特別是巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。其中巨噬細(xì)胞抗瘤作用具有重要意義，巨噬細(xì)胞可能是通過內(nèi)吞和分泌腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素2等效應(yīng)因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗瘤效應(yīng)。乳酸桿菌表面的肽聚糖、脂磷壁酸以及源于細(xì)菌DNA中的大量非甲基化CpG二核苷酸為核心的CpG基序可直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡。CpG基序可活化巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞，從而具有免疫調(diào)節(jié)活性。細(xì)菌核酸中含有CpG基序的部分還通過與人體細(xì)胞表面特異性受體——Toll樣受體家族中的Toll樣受體9（Toll-like receptor，TLR9）相結(jié)合，激活機體的天然免疫反應(yīng)［15-17］。乳酸桿菌基因組AT核苷酸也可以通過與TLR9結(jié)合來增強TH1型免疫反應(yīng)，上調(diào)抗腫瘤免疫反應(yīng)水平［18］。

乳酸桿菌細(xì)胞壁中的肽聚糖和脂磷壁酸是NO合成酶的誘導(dǎo)劑，它們能刺激巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞產(chǎn)生NO。NO是生物體重要的信號分子和活化巨噬細(xì)胞的效應(yīng)分子，可通過以下途徑發(fā)揮抗腫瘤作用:①與腫瘤細(xì)胞代謝關(guān)鍵酶的活性部位FeS基結(jié)合，形成鐵亞硝基復(fù)合物，使酶失活，繼而引起腫瘤細(xì)胞能量代謝障礙;②可滅活DNA合成的限速酶——核糖核酸酶，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖;③可使核酸亞硝基化，導(dǎo)致DNA斷裂，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;④NO與氧結(jié)合，形成強有力的殺傷細(xì)胞的羥自由基和 NO2［19］。Horinaka 等［20］發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌能誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生TRAIL（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand），同時，他們發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌激活自然殺傷細(xì)胞對前列腺癌的殺傷作用是通過誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生TRAIL的途徑實現(xiàn)的。

實體瘤具有低氧代謝區(qū)，乳酸桿菌屬于兼性厭氧菌具有趨低氧代謝特性，對實體瘤有良好的靶向性，并且能夠通過產(chǎn)生過氧化氫和激肽酶發(fā)揮抗實體瘤作用。因此，某些乳酸桿菌可用于腫瘤治療，或作為腫瘤基因治療的轉(zhuǎn)移載體在腫瘤低氧區(qū)域選擇性富集而達(dá)到基因治療目的。

3 基因工程乳酸桿菌的臨床應(yīng)用

由于乳酸桿菌在改善胃腸道功能、維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、提高機體免疫力方面的突出功用，近年來，以乳酸桿菌為宿主菌的基因治療、重組蛋白表達(dá)和疫苗制備等方面的研究受到國內(nèi)外科研工作者的高度重視。

3.1 基因治療 美國和海外研究人員［21］利用人體陰道內(nèi)生菌開發(fā)出一種活性、外用殺菌劑，可以誘導(dǎo)1型人體免疫缺陷病毒蛋白抑制劑的生成并最終防止該病毒的傳播。在這項研究中，研究人員利用從人體陰道分離出的詹氏乳酸桿菌，通過工程化改造，使其可以產(chǎn)生對抗1型人體免疫缺陷病毒受體蛋白的抗1型人體免疫缺陷病毒蛋白質(zhì)RANTES和CIC5 RANTES。兩種RANTES蛋白質(zhì)變體均可抑制1型人體免疫缺陷病毒感染，并對多種1型人體免疫缺陷病毒遺傳亞型有顯著的抑制作用。

3.2 細(xì)胞因子等功能蛋白的體外表達(dá) 利用現(xiàn)代基因工程和生物工程技術(shù)，以乳酸桿菌為載體或宿主菌表達(dá)一些特定功能的蛋白或多肽，可賦予雙歧桿菌更多的醫(yī)用價值。目前，國內(nèi)外很多實驗室已經(jīng)掌握了乳酸桿菌體外表達(dá)融合蛋白的技術(shù)并成功表達(dá)了很多功能蛋白。Miyoshi等［22］通過基因工程方法剔除了乳酸桿菌細(xì)胞外管家蛋白酶HtrA基因，從而使異源蛋白在乳酸桿菌中大量而穩(wěn)定地表達(dá)。

3.3 疫苗 理想的黏膜免疫疫苗可以促進(jìn)抗原和免疫系統(tǒng)之間的有效接觸、刺激體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)、在單劑量免疫以后產(chǎn)生長期的免疫保護(hù)作用，并且穩(wěn)定、無毒性。乳酸桿菌因良好的安全性和免疫佐劑作用，可以作為一種良好的疫苗載體。與采用腺病毒、沙門菌和大腸埃希菌等致病菌為載體的疫苗相比，以乳酸桿菌為載體的疫苗用藥更加安全，適宜多次重復(fù)免疫的要求，更適應(yīng)未來疫苗的發(fā)展趨勢。用乳酸桿菌作為疫苗載體可使口服的乳酸桿菌在體內(nèi)刺激產(chǎn)生黏膜及全身免疫反應(yīng)，促進(jìn)IgA的分泌，提高免疫活性因子的分泌。Aires等［23］利用干酪乳酸桿菌的乳糖操縱子表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了人乳頭狀瘤病毒16的主要衣殼蛋白L1，并通過電子顯微鏡證實表達(dá)的衣殼蛋白L1能夠自我組裝進(jìn)入VLPs（virus-like particles）細(xì)胞內(nèi)。同時，ELISA實驗驗證了小鼠皮下注射乳酸桿菌表達(dá)的衣殼蛋白L1后的小鼠血清中含有人乳頭狀瘤病毒16 L1 VLPs的抗體，為進(jìn)一步開發(fā)研究宮頸癌的黏膜預(yù)防疫苗奠定基礎(chǔ)。

4 展望

乳酸桿菌是益生菌的重要組成成員，在人體胃腸道和泌尿生殖道中以優(yōu)勢菌群廣泛存在，其本身及其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸、過氧化氫、細(xì)菌素、蛋白質(zhì)和各種酶類等，在機體代謝、免疫調(diào)節(jié)等方面起著極為重要的作用。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)蓬勃發(fā)展，人們已經(jīng)不滿足于僅開發(fā)乳酸桿菌自身的食品及臨床應(yīng)用價值。近幾年，乳酸桿菌因具有食品級安全性和局部黏膜定植性及免疫佐劑等特殊性，被廣泛應(yīng)用于疫苗載體的研究，不斷開發(fā)和衍生出了許多更適合功能蛋白表達(dá)、分泌和功能發(fā)揮的菌株和載體質(zhì)粒。但是，目前這方面的成果還局限于科學(xué)研究和動物實驗中，有待于大量的臨床資料驗證。伴隨乳酸桿菌工程菌研究技術(shù)的不斷成熟，科研人員已經(jīng)將乳酸桿菌研究的熱點轉(zhuǎn)移到某些重要細(xì)胞因子和功能蛋白的融合表達(dá)，試圖借助乳酸桿菌良好的靶向定植和免疫佐劑功能，將某些重要的細(xì)胞因子和功能蛋白大量表達(dá)在病灶局部，以期發(fā)揮顯著的治療作用。目前，針對乳酸桿菌的研究，已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但也有很多亟待研究的地方。①乳酸桿菌自身如何發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抗腫瘤等作用的分子機制并不清晰。②乳酸桿菌制劑的質(zhì)量、應(yīng)用于臨床的劑量和時機以及后期疾病轉(zhuǎn)歸等缺乏大量病例資料統(tǒng)計、歸納。③乳酸桿菌作為原核生物表達(dá)的蛋白多為胞內(nèi)蛋白，如何將重組蛋白分泌到胞外且具備人體內(nèi)正常的折疊、修飾和生物學(xué)功能等需要后期大量的研究。④乳酸桿菌作為疫苗、重要細(xì)胞因子和功能蛋白的載體時，一旦這些蛋白進(jìn)入人體細(xì)胞或釋放到外環(huán)境中，導(dǎo)致的結(jié)果尚不明確。隨著乳酸桿菌基因工程表達(dá)系統(tǒng)的完善及深入研究，乳酸桿菌在未來的食品生產(chǎn)和臨床應(yīng)用中將展示出廣闊的應(yīng)用前景。

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