何 苗（綜述），王子衛(wèi)（審校）

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科，重慶 400016）

表觀(guān)遺傳指不涉及DNA序列改變的，可隨細(xì)胞分裂而遺傳的基因組修飾作用，包括DNA甲基化（DNA methylation）、組蛋白修飾（如乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化等）、染色質(zhì)重塑、基因組印跡、RNA干擾（RNA interference，RNAi）等。表觀(guān)遺傳參與基因表達(dá)調(diào)控，提供DNA編碼信息的時(shí)空表達(dá)指令。表觀(guān)遺傳學(xué)即研究表觀(guān)遺傳現(xiàn)象規(guī)律的科學(xué)，主要從基因組修飾角度研究基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。DNA甲基化和RNA干擾（特別是小RNA）是表觀(guān)遺傳學(xué)研究焦點(diǎn)和重心。不少研究證實(shí)，DNA甲基化異?；騌NA干擾異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］?，F(xiàn)就DNA甲基化與小RNA基本理論進(jìn)行概述，并綜述它們?cè)谀[瘤研究中的聯(lián)系。

1 DNA甲基化理論概述

DNA甲基化是在甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMTs）作用下，由S-腺苷酰-L-甲硫氨酸提供甲基，在DNA分子胞嘧啶5號(hào)碳原子上結(jié)合甲基團(tuán)，形成5-甲基胞嘧啶，生成甲基化DNA［2］。其有如下特點(diǎn):常發(fā)生于DNA分子5'-CpG-3'序列，而基因啟動(dòng)子常富集CpG序列（即CpG島）;作用于DNA復(fù)制后，轉(zhuǎn)錄前，不改變DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄;是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)DNA合成后唯一自然修飾方式。DNA甲基化調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制是:甲基化DNA與甲基化CpG結(jié)合蛋白（methyl-CpG-binding protein，MeCPs）結(jié)合，MeCPs的MBD結(jié)構(gòu)域（methyl-CpG-binding domain，MBD）通過(guò)招募組蛋白去乙?；感纬赊D(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，進(jìn)而促使染色體形態(tài)改變，不利于DNA解旋和解鏈，最終抑制基因轉(zhuǎn)錄［3］。即 DNA 甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄。通常各種細(xì)胞具有相對(duì)特異的基因組甲基化譜，這在促進(jìn)組織器官發(fā)育、維持細(xì)胞正常功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境等方面發(fā)揮重要作用。但腫瘤細(xì)胞中，正常甲基化模式異常改變，表現(xiàn)為全基因組廣泛低甲基化及抑癌基因高甲基化［4］，目前在不同腫瘤中已證實(shí)多種抑癌基因高甲基化，且與腫瘤分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、臨床分級(jí)、復(fù)發(fā)、預(yù)后等密切相關(guān)［5］。故各類(lèi)腫瘤相對(duì)特異的異常甲基化譜可望用于腫瘤診治［6］。

2 小RNA理論概述

RNAi是部分特殊RNA誘導(dǎo)同源基因mRNA降解或抑制其翻譯，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的現(xiàn)象。RNAi通常是轉(zhuǎn)錄后水平的遺傳信息調(diào)控（區(qū)別于DNA甲基化的轉(zhuǎn)錄水平）。目前，腫瘤中對(duì)RNAi現(xiàn)象的研究集中在小RNA，包括微小RNA（microRNA，miRNA）和小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）。

2.1 miRNA基本理論 miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)18～26 nt的非編碼小分子核苷酸，源于生物自身基因組。細(xì)胞核內(nèi)miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ作用下先產(chǎn)生初級(jí) miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA在胞核內(nèi)被RNA酶Ⅲ切割為發(fā)夾狀miRNA前體（pre-miRNA），pre-miRNA再被 exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，由 RNA酶Ⅲ進(jìn)一步切割為 miRNA:miRNA雙鏈［7］，然后其中一條鏈被降解，遂形成成熟miRNA。miRNA可與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）選擇性結(jié)合，成熟單鏈miRNA在RISC中通過(guò)堿基互補(bǔ)結(jié)合于同源基因mRNA，并降解或抑制該mRNA翻譯，從而調(diào)控基因表達(dá)［8］（圖1）。人類(lèi)基因中約1/3受miRNA表達(dá)調(diào)控，涉及生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡、增殖、腫瘤等領(lǐng)域。由于miRNA源于生物自身基因組，故基于miRNA的RNAi是生物自身參與基因表達(dá)調(diào)控的方式。

2.2 siRNA基本理論 siRNA源于雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）。dsRNA分子在胞質(zhì)中經(jīng)RNA酶Ⅲ切割為21～23 nt的小片段，即形成siRNA。siRNA在解旋酶作用下分解為兩條單鏈，由反義鏈與核酸內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等結(jié)合形成RISC。單鏈siRNA在RISC中與同源基因mRNA通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合，并降解此mRNA或抑制其翻譯，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控［9］（圖1）。因 dsRNA源自外來(lái)病毒、轉(zhuǎn)座子或自身基因組，故基于siRNA的RNAi是生物自身及外來(lái)遺傳物質(zhì)參與基因表達(dá)調(diào)控的共同途徑。

3 DNA甲基化與小RNA在腫瘤中的關(guān)聯(lián)研究

3.1 miRNA的DNA甲基化調(diào)控 腫瘤研究已證實(shí)部分腫瘤相關(guān)miRNA受DNA甲基化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié);腫瘤中miRNA異常與其基因甲基化異常相關(guān)。例如Hashimoto等［10］采用 miRNA 芯片及定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)研究胃癌，發(fā)現(xiàn)胃癌組織及細(xì)胞中miR-181c顯著降低，而miR-181c基因CpG島是異常甲基化的;用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-CdR處理胃癌細(xì)胞可激活miR-181c，并抑制胃癌增殖。Ando等［11］也發(fā)現(xiàn)具有抑癌作用的miR-124a在正常胃黏膜、癌旁組織、胃癌組織中表達(dá)逐漸降低，而其基因異常甲基化程度卻在上述組織中逐漸明顯，并與Hp感染顯著相關(guān)。Tsai等［12］研究人19號(hào)染色體的miRNA基因簇（C19MC），也發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)組織中C19MC因序列上游17.6 kb處CpG島低甲基化而高表達(dá)，但在胃癌細(xì)胞AGS和宮頸癌細(xì)胞HeLa中卻因高甲基化而不表達(dá);5-aza-CdR可激活C19MC并抑制AGS及HeLa增殖。Huang等［13］研究子宮內(nèi)膜癌，也發(fā)現(xiàn)miR-129-2異常表達(dá)與其異常甲基化相關(guān)。Vrba等［14］研究乳腺上皮腫瘤和乳腺間質(zhì)腫瘤，也證實(shí)miR-200c表達(dá)差異受DNA甲基化和組蛋白修飾調(diào)節(jié)。類(lèi)似發(fā)現(xiàn)還很多，提示DNA甲基化不僅調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達(dá)，也調(diào)節(jié)miRNA。

3.2 間接作用于DNA甲基化的miRNA 這里的“間接作用”指部分miRNA通過(guò)靶向抑制DNMTs或MeCP2而間接改變腫瘤基因甲基化譜，從而間接調(diào)節(jié)腫瘤基因轉(zhuǎn)錄。例如，Das等［15］探索了全反式維甲酸促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化的表觀(guān)遺傳機(jī)制。發(fā)現(xiàn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤中全反式維甲酸可促進(jìn)miR-152表達(dá)，而miR-152可靶向抑制甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1和DNMT3B，從而激活了因異常甲基化而失活的82種基因，最終促進(jìn)腫瘤分化。Braconi等［16］探索了炎性因子白細(xì)胞介素6參與膽管上皮癌發(fā)生的表觀(guān)遺傳機(jī)制。發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素6可抑制miR-148a、miR-152、miR-301表達(dá)，而這些 miRNA正好靶向抑制 DNMT1;高表達(dá)的 DNMT1促使抑癌基因 Rassf1a及p16INK4a異常甲基化并失活，終致腫瘤發(fā)生。Garzon等［17］研究急性髓樣白血病也發(fā)現(xiàn)，miR-29b可靶向抑制甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A和DNMT3B，從而改變基因組甲基化譜;如抑癌基因p15和ESR1就在轉(zhuǎn)染miR-29b后因啟動(dòng)子去甲基化而激活，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞。

Wada等［18］研究8種胃癌細(xì)胞及11例胃癌組織，發(fā)現(xiàn) miR-212在胃癌中顯著降低;而轉(zhuǎn)染 primiR-212可抑制胃癌細(xì)胞增殖。進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)，miR-212靶向抑制甲基化CpG結(jié)合蛋白MeCP2;轉(zhuǎn)染pri-miR-212可抑制MeCP2蛋白表達(dá)，但不影響其mRNA水平。因MeCP2是參與DNA甲基化抑制轉(zhuǎn)錄的重要功能蛋白，故推測(cè)miR-212可通過(guò)調(diào)節(jié)MeCP2而影響基因甲基化對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。

利用生物信息學(xué)技術(shù)（如miRanda、PicTar等）還可預(yù)測(cè)很多靶向DNMTs及MeCPs的miRNA。結(jié)合上述研究，推測(cè)miRNA不僅受DNA甲基化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，也間接反作用于DNA甲基化，并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。

3.3 間接作用于DNA甲基化的siRNA siRNA是RNA干擾的重要成員，但腫瘤研究中對(duì)內(nèi)源性siRNA關(guān)注較少，故甚少見(jiàn)DNA甲基化調(diào)節(jié)siRNA的報(bào)道。目前siRNA常為人工合成，并作為抑制靶基因的科研工具而廣泛用于腫瘤基因功能研究。已不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)，靶向抑制 DNMTs和 MeCPs的外源性siRNA可間接調(diào)節(jié)腫瘤基因甲基化譜。如 Deng等［19］構(gòu)建Dnmt3a-siRNA并將之轉(zhuǎn)染黑素瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Dnmt3a被剔除后，黑素瘤細(xì)胞中主要組織相容復(fù)合體Ⅰ（MHCⅠ）、主要組織相容復(fù)合體Ⅱ（MHCⅡ）、反式作用子Ⅱ（Ciita）等基因發(fā)生去甲基化并重新表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Lopez-Serra等［20］研究了 MeCPs的 MBD 結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建靶向MBD-mRNA的siRNA，發(fā)現(xiàn)抑制MBD后，宮頸癌細(xì)胞HeLa中部分因異常甲基化而失活的基因可重新表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Kim等［21］研究一種特殊甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3L。構(gòu)建Dnmt3L-siRNA轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Dnmt3L被剔除后，共有242種基因甲基化譜發(fā)生改變，其中204種的甲基化譜是Dnmt3L與 Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b共同參與調(diào)節(jié)的，而有15種基因甲基化譜是由Dnmt3L單獨(dú)調(diào)節(jié)的，如胸腺嘧啶轉(zhuǎn)葡糖激酶等。Kurita等［22］構(gòu)建DNMT1-siRNA及DNMT3b-siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)肝癌的增殖受抑制及凋亡增加，且對(duì)化療的敏感性增強(qiáng)。進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)，DNMT1及 DNMT3b被siRNA剔除后，肝癌中因啟動(dòng)子甲基化而失活的caspase-8可重新轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制肝癌。目前，這種DNMTS-siRNA介導(dǎo)的腫瘤基因甲基化調(diào)節(jié)逐漸被重視，并可望用于腫瘤基因治療。

3.4 直接作用于DNA甲基化的siRNA及miRNA“直接作用”指不通過(guò)靶向DNMTs而直接結(jié)合靶基因并誘導(dǎo)其DNA甲基化。例如，Kawasaki等［23］研究乳腺癌細(xì)胞MCF-7，發(fā)現(xiàn)靶向E-cadherin及HER2啟動(dòng)子CpG島的外源性siRNAs可顯著促進(jìn)兩種基因啟動(dòng)子甲基化，并抑制它們轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，剔除 DNMT1和 DNMT3B后，上述 siRNA介導(dǎo)的DNA甲基化抑制現(xiàn)象則消失。提示siRNA可靶向結(jié)合基因啟動(dòng)子，并在DNMTs作用下促進(jìn)該基因甲基化，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄。Tan等［24］研究了多種腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) miR-10a可抑制 hoxd4表達(dá)。分析原因發(fā)現(xiàn)miR-10a可靶向結(jié)合hoxd4啟動(dòng)子CpG島，并促進(jìn)hoxd4啟動(dòng)子甲基化;且用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理癌細(xì)胞后，上述miR-10a介導(dǎo)的hoxd4甲基化轉(zhuǎn)錄抑制也消失。提示miRNA亦可靶向結(jié)合基因啟動(dòng)子，并通過(guò)DNMTs促進(jìn)基因甲基化而抑制轉(zhuǎn)錄。

上述siRNA或miRNA直接靶向基因并導(dǎo)致啟動(dòng)子甲基化的機(jī)制尚不清。有學(xué)者認(rèn)為這種小RNA介導(dǎo)的靶基因甲基化修飾是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子TTF-1，并被DNMT3b特異識(shí)別而實(shí)現(xiàn)的［25］。腫瘤中類(lèi)似研究尚少，需繼續(xù)探索。

4 總結(jié)及展望

miRNA及siRNA與DNA甲基化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的關(guān)系十分密切。miRNA不僅受DNA甲基化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，也通過(guò)靶向Dnmts或MeCPs間接反作用于基因甲基化。這是對(duì)miRNA靶向mRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的補(bǔ)充。siRNA通常是轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶蛋白表達(dá)的科研工具，現(xiàn)也證明靶向Dnmts或MeCPs的siRNA可間接改變基因組甲基化譜，從而用于腫瘤治療。此外，植物中內(nèi)源性siRNA可直接結(jié)合靶基因并調(diào)節(jié)其DNA甲基化譜［26］;雖類(lèi)似的siRNA或miRNA直接介導(dǎo)靶基因甲基化的報(bào)道已在腫瘤中出現(xiàn)，但還相對(duì)欠缺，且腫瘤中內(nèi)源性siRNA是否受DNA甲基化調(diào)節(jié)也不清楚，故需繼續(xù)探索。

細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)常先出現(xiàn)表觀(guān)遺傳異常，例如，抑癌基因異常甲基化、癌基因去甲基化、miRNAs異常表達(dá)等。對(duì)它們的檢測(cè)和調(diào)節(jié)將對(duì)腫瘤診治產(chǎn)生巨大影響，這是腫瘤基因診療未來(lái)的研發(fā)方向。具體歸納如下:①探索各類(lèi)腫瘤不同階段基因組甲基化譜差異和miRNAs差異，為腫瘤分子診斷提供依據(jù);②異常甲基化的病因研究，為腫瘤預(yù)防提供理論依據(jù);③腫瘤基因異常甲基化靶向治療研究，在轉(zhuǎn)錄水平治療腫瘤;④建立siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并持續(xù)作用的方法，在轉(zhuǎn)錄后水平治療腫瘤;⑤因RNAi機(jī)制復(fù)雜，且其靶向性并非絕對(duì)特異，故人工RNAi技術(shù)對(duì)細(xì)胞的毒副作用尚待探索。

近年表觀(guān)遺傳學(xué)在腫瘤方面的研究突飛猛進(jìn)，但人們清楚的仍舊是冰山一角。表觀(guān)遺傳貫穿生命全過(guò)程，作用巨大，人類(lèi)表觀(guān)基因組計(jì)劃是宏偉而艱苦的工程，需要更多學(xué)者前赴后繼地探索。

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