牛 萍 趙月強 張端蓮

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞過程中Notch表達(dá)的研究

牛 萍＊趙月強 張端蓮1

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院兒科；1武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，武漢430060）

目的 研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞過程中Notch表達(dá)的研究。方法 用密度梯度離心法分離培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，按照酶法及差速貼壁法分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞。觀察干細(xì)胞增殖及傳代情況。單獨培養(yǎng)的干細(xì)胞為對照組，實驗組將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)、MTT等方法檢測干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的情況，及干細(xì)胞在增殖與分化為心肌細(xì)胞過程中Notch信號系統(tǒng)的表達(dá)情況。結(jié)果 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈梭形、旋渦樣生長，增殖及傳代能力強，并可誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞，免疫熒光示心肌細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)顯示實驗組有Notch信號通路受體及配體的表達(dá)，而對照組表達(dá)微弱。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在增殖及分化過程中存在Notch信號通路，在干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞過程中Notch信號系統(tǒng)的表達(dá)上調(diào)。

信號通路；干細(xì)胞；分化；心肌細(xì)胞；表達(dá)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在特定微環(huán)境及適宜的細(xì)胞因子的作用下，可分化成多種組織細(xì)胞，已成為組織工程、細(xì)胞及基因治療的理想的靶細(xì)胞。并且由于其低免疫原性，在組織構(gòu)建和再生醫(yī)學(xué)中得到了廣泛運用［1-3］。因此，找到與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化相關(guān)的信號通路，通過精確調(diào)控信號通路，來誘導(dǎo)干細(xì)胞向特定的細(xì)胞系分化，就可為組織構(gòu)建提供大量的功能細(xì)胞，具有重要的臨床意義。有研究表明Notch信號系統(tǒng)幾乎涉及所有細(xì)胞的增殖、分化活動，其通過臨近細(xì)胞間的相互作用來調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，從而精確調(diào)控各譜系細(xì)胞的增殖與分化［3］。本研究旨在探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化為心肌細(xì)胞過程中，是否存在Notch信號通路，以及其具體的作用。

材料和方法

1.材料

實驗犬（體重12-20kg）11只，雌雄不拘，乳鼠10只（出生小于24h），均由我院實驗動物中心提供。胎牛血清（美國Gibco公司），DMEM，膠原酶，胰蛋白酶（美國Sigma公司），Notch1多克隆抗體及Jagged1多克隆抗體（美國Cell signalling公司），兔抗鼠肌鈣蛋白T抗體（武漢博士德公司），鼠抗人連接蛋白43多克隆抗體（CX43，美國Zymed公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG及CY3標(biāo)記的羊抗兔IgG（美國Sigma公司）。RT-PCR試劑盒（美國Sigma公司）。倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)。

2.方法

2.1 犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)蘇、擴增及傳代

3%戊巴比妥鈉（30mg／kg）麻醉犬，從脛骨平臺處抽取骨髓液5ml（注射器內(nèi)含肝素0.5ml），混勻防凝；將所抽取骨髓液放入15ml消毒離心管，加等量無血清DMEM 培養(yǎng)液（5ml）稀釋混勻，離心（1100rpm，5min），去除上層脂肪滴。取15ml消毒離心管，先加入5ml Percoll分層液，在分層液界面上小心加入與分層液等量的稀釋骨髓液（5ml），分層離心（1500rpm，20min）。用吸管小心吸取中間分層液界面的絮狀物至另一離心管，此絮狀物富含所分離的單個核細(xì)胞，加入10mlDMEM培養(yǎng)液混勻，洗滌離心（1100rpm，5min）二次，去除上清液，沉積物用5mlDMEM＋10%FBS懸浮，以1×106／ml密度接種細(xì)胞于一次性塑料培養(yǎng)瓶中，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h后首次換液，去除未貼壁的細(xì)胞，以后每3d換一次液，待細(xì)胞培養(yǎng)7-10d，細(xì)胞融合約80%時，傳代培養(yǎng)。去除培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入0.125%胰蛋白酶＋1%EDTA2ml，消化3min，棄消化液，加入6ml含血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，吸管吹打細(xì)胞，以1：2傳代擴增。將傳代后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞隨機分為二組，一組單獨培養(yǎng)，為對照組，一組與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，為實驗組。

2.2 心肌細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

按照酶法及差速貼壁法分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞。于無菌操作下，將乳鼠的心室肌剪成1mm3大小的碎塊，用DMEM洗1次。棄去帶血的上清液，組織碎塊中加入含0.125%胰蛋白酶，0.1%膠原酶消化，每次37℃消化4min，首次消化液棄去，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含有10mlDMEM培養(yǎng)液的無菌試管中，并以1000r／min離心5min，棄上清液，細(xì)胞沉淀再次用培養(yǎng)液重懸。細(xì)胞懸液置于平皿中37℃靜置。1h后，小心吸出細(xì)胞懸液，接種到六孔板中備用。

2.3 MSCs與心肌細(xì)胞的共培養(yǎng)

將部分 MSCs用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）標(biāo)記細(xì)胞核30min，用D-Hanks液漂洗10遍，與心肌細(xì)胞按照1：4的比例，接種于覆有蓋玻片的六孔板進(jìn)行共同培養(yǎng)。于培養(yǎng)后第五天檢測搏動頻率及分化比率的變化。用RT-PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測Notch信號因子的表達(dá)及心肌細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。

2.4 免疫熒光檢測心肌標(biāo)志物的表達(dá)

將各組制成的細(xì)胞爬片用PBS洗凈，固定，羊血清封閉，加入1∶100稀釋的兔抗鼠TnT抗體，鼠抗人連接蛋白43多克隆抗體，孵育漂洗干凈后，分別加入CY3標(biāo)記的羊抗兔IgG及FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育，漂洗，晾干封片，熒光顯微鏡下觀察。

2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測信號系統(tǒng)細(xì)胞因子的表達(dá)

將各組制成的細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析，將玻片PBS漂洗數(shù)次，加入4%多聚甲醛固定30min，后用PBS漂洗干凈，再加入牛血清白蛋白封閉，用PBS漂洗，后加入1∶100稀釋的Jagged1抗體及Notch1多克隆抗體，室溫孵育120min，用PBS漂洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG于室溫孵育90min，PBS漂洗干凈，將DAB濃縮顯色液稀釋后滴加于玻片顯色，以PBS浸洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，漂洗，脫水，封片，鏡下觀察各組表達(dá)變化。陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，均呈棕黃色或棕褐色顆粒樣分布。鏡下觀察染色強度，按信號強弱程度將陽性細(xì)胞分為三個等級：著色淺棕色為弱陽性；棕褐色為陽性；無著色為陰性。

2.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測Notch1基因的轉(zhuǎn)錄

共培養(yǎng)后第七天，用Trizol試劑提取實驗組與對照組細(xì)胞的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所用引物根據(jù)其Genebank上所查序列使用Primer 5.0軟件自行設(shè)計。擴增條件為94℃預(yù)變性2min，PCR循環(huán)35個，94℃變性50s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循環(huán)完成后，72℃延伸5min。Notch1的引物序列為：5 ’-TGTGACAGCCAGTGCAACTC-3 ’； 5 ’-GCAGTGCTTCCAGAGTGCCA-3’，所 得 cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察。并對電泳圖譜上的條帶進(jìn)行圖像分析，計算各基因與GAPDH吸收峰面積之比值。

3. 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料的數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，其結(jié)果的比較用t檢驗，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖

剛接種的細(xì)胞懸液中90%以上為單個核細(xì)胞，48h首次換液后，幾乎所有細(xì)胞都貼壁，變成橢圓形，少部分已變成梭形。第5d更換培養(yǎng)液時，可見散在分布的貼壁細(xì)胞，逐漸聚集在一起，形成多個克隆，逐漸增殖生長，第7至10d，細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞排列具有方向性，呈旋渦樣生長，旋渦中心細(xì)胞呈多層分布，細(xì)胞形態(tài)呈細(xì)長的梭形，折光性強，融合70-90%。傳代后細(xì)胞增長迅速，倍增時間為21h，第3至4d，達(dá)到高峰期，第7d左右進(jìn)入平臺期（圖1-2）。

2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)

普通光鏡下可見骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分裂，變成菱形、多角形、寬梭形等形狀，穿插在心肌細(xì)胞之中，變成圓柱形聚集在一起，可見明暗相間的橫紋，形成放射狀細(xì)胞簇，一起同步收縮，出現(xiàn)節(jié)律性搏動。干細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)后的第三天，約有42%的干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，與心肌細(xì)胞一起出現(xiàn)自發(fā)性搏動，頻率為46±13次／分，以后逐漸增長到76±11次／分，細(xì)胞分化比率提高到84%，到第八天時，仍有自主搏動，頻率為71±12次／分（圖3）。

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線。第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞增殖旺盛，倍增時間為21h，第7d左右進(jìn)入平臺期。圖3 共培養(yǎng)后細(xì)胞搏動頻率及分化比率的比較。干細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)后的搏動頻率由46±13次／分逐漸增長到76±11次／分，并持續(xù)到第八天。細(xì)胞分化比率從大約42%提高到84%Fig.2 Growth curve of mesenchymal stem cells.Mesenchymal stem cells of passage 3growed productively and entered the platform in the seventh day.Fig.3 Comparison of beating rate and rate of differentiation.Spontaneously beating rate increased from 46±13bpm to 76±11bpm.The rate of differentiation increased from 42%to 84%.

3.免疫熒光檢測心肌細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

結(jié)果顯示肌鈣蛋白TnT在實驗組有表達(dá)，對照組無表達(dá)，說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。培養(yǎng)的干細(xì)胞及心肌細(xì)胞間可見間隙連接蛋白CX43的表達(dá)，分布在胞漿與胞膜（圖4）。藍(lán)色熒光代表干細(xì)胞的核，紅色熒光代表TnT，綠色熒光代表CX43。說明干細(xì)胞與心肌細(xì)胞間形成了電機械偶聯(lián)。

4.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測Notch信號系統(tǒng)的表達(dá)

二組均可見Notch信號系統(tǒng)受體及配體的表達(dá)，實驗組較對照組表達(dá)強烈。說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在分化為心肌細(xì)胞過程中，Notch信號系統(tǒng)的表達(dá)上調(diào)（圖5）。

5.Notch通路信號分子mRNA的表達(dá)

實驗組可見Notch1信號通路受體及配體的表達(dá)，而對照組表達(dá)微弱。說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在增殖及分化過程中存在Notch信號通路，在干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞過程中Notch1信號系統(tǒng)的表達(dá)上調(diào)，顯示Notch1對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞起正向調(diào)控作用（圖6）。

討 論

Notch信號通路廣泛存在于各種動物細(xì)胞中，在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。完整的Notch信號通路包括Notch受體、Notch配體、CSL DNA結(jié)合蛋白、靶基因和效應(yīng)物等。目前得到公認(rèn)的Notch信號傳遞過程，是Notch受體與臨近細(xì)胞表面配體相結(jié)合后，Notch蛋白相繼發(fā)生水解，其胞內(nèi)區(qū)（NIC）被切割，從細(xì)胞膜上脫離，轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞核并與轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)合，激活Notch誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖和分化的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄［4-6］。它的配體和受體都是細(xì)胞膜表面蛋白，信號通訊被限于兩相鄰細(xì)胞間進(jìn)行。因此，是介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的一種重要方式。

圖6 RT-PCR檢測Notch信號系統(tǒng)的表達(dá)。A中1為Marker，2為干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞，3為干細(xì)胞，可見二組均有Notch1及Jagged1的表達(dá)，2組較3組表達(dá)強。B為各組基因與GAPDH吸收峰面積之比值，心肌細(xì)胞組較干細(xì)胞組比值高。Fig.6 Expression of Notch1and Jagged1by RT-PCR.1：Marker；2：cardiomyocytes from MSCs；3：Mesenchymal stem cells.Both of group had the gene expression，and 2 group expressed more highly than 3group；B indicated the ratio of fluorescence of gene fragment.

目前在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞以及成骨細(xì)胞分化過程中，均發(fā)現(xiàn)Notch信號系統(tǒng)的重要參與［7-8］。最近國外學(xué)者研究，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化過程中，Notch起重要的調(diào)控作用。當(dāng)JAG1蛋白被下調(diào)時，平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志物表達(dá)下降，說明激活Notch信號系統(tǒng)，可促使 MSCs向平滑肌細(xì)胞分化［9］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在模擬的心臟微環(huán)境中分化為心肌細(xì)胞，有學(xué)者通過直接接觸與間接接觸心肌細(xì)胞兩種方法，研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的比率，結(jié)果表明直接接觸是促進(jìn)MSC向心肌樣細(xì)胞分化的重要因素，兩種細(xì)胞間直接接觸可能使MSC接受向心肌細(xì)胞定向分化的某種特異性信號［10-11］。Notch信號可直接由相鄰細(xì)胞間接觸傳遞，并傳導(dǎo)至細(xì)胞核，激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，其不需第二信使和蛋白激酶的參與，因此，此種傳導(dǎo)方式能對細(xì)胞的分化過程起到精細(xì)調(diào)控作用［12］。

為了檢驗Notch信號系統(tǒng)是否對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及分化也有調(diào)控作用，用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中存在Notch1-Jagged1通路，說明Notch信號系統(tǒng)對體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有調(diào)控作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外增殖能力強，可傳多代，并可誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞。說明其有多向分化潛能［13］。為了明確具體的調(diào)控作用，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，研究分化后Notch信號通路表達(dá)情況。結(jié)果顯示Notch信號系統(tǒng)對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與分化有調(diào)控作用，干細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)時，Notch信號系統(tǒng)表達(dá)微弱；當(dāng)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化時，Notch信號系統(tǒng)表達(dá)增強，說明Notch信號系統(tǒng)對干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞有誘導(dǎo)作用。得出Notch信號對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞起重要的調(diào)控作用。說明如果激活Notch信號系統(tǒng)，使其表達(dá)上調(diào)，可促使MSCs向心肌細(xì)胞分化，這為下一步的實驗提供了理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多潛能性決定了其分化調(diào)控機制的復(fù)雜性。在這樣一個復(fù)雜的調(diào)控機制中，是多種信號系統(tǒng)參與的結(jié)果［14］。有學(xué)者認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中存在分化為各種功能細(xì)胞的目的基因，在分化的不同階段，會有不同的基因表達(dá)，這種事件是隨機的，受微環(huán)境、細(xì)胞因子及信號系統(tǒng)等影響。如果加入誘導(dǎo)因子或細(xì)胞及信號通路調(diào)節(jié)子，增強目的基因表達(dá)，抑制其他基因表達(dá)，就可使干細(xì)胞向目的細(xì)胞分化［15-16］?？傊?，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的分子機制復(fù)雜，要想系統(tǒng)性地闡釋干細(xì)胞多向分化的分子機制還有待投入更多的工作。但從目前研究結(jié)果可以看出，Notch信號通路對于干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞起著重要的調(diào)控作用，提示其有重要性和應(yīng)用前景。如果能找到調(diào)節(jié)Notch信號途徑的有效方式，就可以通過Notch信號的改變來精確調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與定向分化，為臨床和科研提供各種功能細(xì)胞或目的細(xì)胞。

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圖 版 說 明

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。A為在普通顯微鏡下可見培養(yǎng)后第4d的骨髓干細(xì)胞呈菱形、多角形、寬梭形等形狀，逐漸變形聚集在一起。B為傳代后第3d的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈細(xì)長的梭形，折光性強，呈旋渦樣生長，融合70-90%。（×100）

圖4 細(xì)胞誘導(dǎo)后心肌標(biāo)志物的表達(dá)。A、C組為共培養(yǎng)組，分別可見TnT及CX43的表達(dá)，B、D組為單純干細(xì)胞組，未見TnT表達(dá)，CX43表達(dá)微弱。（×400）

圖5 細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞因子及心肌標(biāo)志物的表達(dá)。A、C組為共培養(yǎng)組，分別可見Notch1及Jagged1的表達(dá)，B、D組為單純干細(xì)胞組，Notch1及Jagged1表達(dá)微弱。（×400）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Mesenchymal stem cells in culture.A indicated that MSCs appeared as heterogeneous groups of large flat cells，smaller spindle-shaped cells，and formed focal areas of cell aggregation after 4days of coculture.B indicated that mesenchymal stem cells of passage 3had confluence of 70-90% .（×100）

Fig.4 Expression of TnT and CX43after induction of MSCs.A and C indicated cardiomyocytes from MSCs had expression of TnT and CX43；B indicated MSCs had no expression of TnT，D indicated MSCs had weaker expression of CX43.（×400）

Fig.5 Expression of Jagged1and Notch1after induction of MSCs.A and C indicated cardiomyocytes from MSCs had expression of Jagged1and Notch1；B and D indicated MSCs had weaker expression of Jagged1and Notch1.（×400）

The study of expression of Notch signaling in the differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocytes

Niu Ping＊，Zhao Yueqiang，Zhang Duanlian1
（Department of Pediatrics，Renmin Hospital of Wuhan University；1Department of Anatomy，Histology and Embryology，Wuhan University，Wuhan 430060，China）

Objective To investigate the expression of Notch signaling of the differentiation of mesenchymal stem cells（MSCs）into cardiomyocytes.Methods MSCs were isolated from canine bone marrow and cultured with cell culture techniques，and then cardiomyocyte differentiation wad induced.The identification of the differentiation of MSCs and the Notch signal was carried out by RT-PCR and immunohistochemistry.MTT method was used to calculate the growth curve.Results MSCs looked fusiform under light microscopy.MSCs differentiated into cardiomyocytes.Immunofluorescence showed a significantly increased expression of TnT and CX43.RT-PCR and immunohistochemistry showed that the protein of the Notch signal was expressed during differentiation，and the level of expression was significantly lower during proliferation.Conclusion The Notch signaling system participates in the proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells，and its expression increased during the differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocytes.

Notch signal pathway；Stem cell；Differentiation；Cardiomyocyte；Expression

R329

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.001

2011-03-11

2011-09-21

國家自然科學(xué)基金（30801131）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（200804861045）

牛萍，女（1978年），漢族，主治醫(yī)師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）