屈長(zhǎng)青 許艷華 代向向

益母草水提物對(duì)小鼠前體脂肪細(xì)胞體外增殖能力的影響

屈長(zhǎng)青1，2＊許艷華1代向向1

（1阜陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院；2抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽阜陽(yáng)236041）

目的 探討益母草水提物對(duì)小鼠前體脂肪細(xì)胞的增殖的影響，旨在了解益母草新的藥用價(jià)值。方法 分離培養(yǎng)小鼠前體脂肪細(xì)胞，取傳代細(xì)胞，用不同濃度的益母草水提物處理，MTT法檢測(cè)前體脂肪細(xì)胞增殖情況。結(jié)果 益母草水提物可明顯抑制小鼠前體脂肪細(xì)胞的體外增殖，并呈一定的劑量依賴性，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

益母草水提物；小鼠；前體脂肪細(xì)胞；增殖

近年來(lái)，隨著肥胖人群的日益增多，由此引發(fā)的各種疾病的發(fā)病率也日益攀升，給人們的健康造成了嚴(yán)重的威脅。經(jīng)研究，體內(nèi)脂肪細(xì)胞的數(shù)目過(guò)多或體積過(guò)大都會(huì)導(dǎo)致甘油三酯等的過(guò)多積累，進(jìn)而在一定程度上引起脂肪層的過(guò)度增厚［1］。唇形科植物益母草（Leonurus Japonicus Houtt）味苦、微寒，有活血、降脂、消炎鎮(zhèn)痛等功效，自古以來(lái)就享有“血家圣藥”的美稱［2］。益母草提取實(shí)驗(yàn)表明其化學(xué)成分主要是黃酮類(lèi)、有機(jī)酸、生物堿類(lèi)等，此外還含有對(duì)人體有益的多種微量元素，其中研究較多的是生物堿類(lèi)［3］。隨著現(xiàn)代對(duì)中草藥研究方法的不斷創(chuàng)新和改進(jìn)，益母草在其他諸方面的藥用價(jià)值也不斷被發(fā)現(xiàn)［4］，但其對(duì)于減肥作用的研究和應(yīng)用尚不多，為此，現(xiàn)就益母草水提物對(duì)于小鼠前體脂肪細(xì)胞體外增殖的抑制作用進(jìn)行探索，以期為益母草在控制肥胖方面的應(yīng)用提供參考。

材料和方法

1.材料

清潔級(jí)四周齡雄性小鼠6只，由胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

2.主要試劑

Ⅰ型膠原酶消化液；PBS緩沖液；胰酶消化液 ；MTT溶液；無(wú)血清 M199培養(yǎng)液；10%血清 M199培養(yǎng)液。

3.方法

3.1 小鼠前體脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)［5，6］

小鼠斷頸處死，置于75%酒精中浸泡3-5min，無(wú)菌緩沖間內(nèi)用滅過(guò)菌的解剖器械剪開(kāi)小鼠皮膚，小心分離小鼠腹股溝處的帶狀脂肪組織，PBS沖洗3次，用眼科剪將其剪成1mm3左右的小塊，按照細(xì)胞：酶液＝1∶2的體積比加入Ⅰ型膠原酶消化液，37℃恒溫箱中消化60min（每5min振蕩一次），加入等量的10%血清M199培養(yǎng)液終止消化，細(xì)胞篩過(guò)濾以除去未被消化的脂肪組織碎片，2000r／min離心5min，棄上清液，加入適量的無(wú)血清M199培養(yǎng)液2000r／min離心5min，棄上清液，再加入適量的10%血清M199培養(yǎng)液吹打混勻成細(xì)胞懸液，接種至30mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1d后換液，以后每2d換液一次。

3.2 不同濃度益母草水提物培養(yǎng)液的配制

稱取1g益母草加入200ml雙蒸水中浸泡過(guò)夜，超聲波提取兩次，每次40min，雙層濾紙過(guò)濾后濃縮備用。濃縮液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后用10%血清M199培養(yǎng)液分別配成1.0mg／mL、1.5mg／ml、2.0mg／ml、2.5mg／m、3.0mg／ml五種濃度的溶液各5ml，分別標(biāo)記為AEMH1-5，裝于青霉素小瓶中，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 小鼠前體脂肪細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)5d左右即可長(zhǎng)成覆蓋率為70%-80%的細(xì)胞單層，此時(shí)取出長(zhǎng)滿細(xì)胞的30mm培養(yǎng)皿，吸棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，加入1ml經(jīng)預(yù)溫處理的胰酶消化液，置于倒置顯微鏡下觀察，待貼壁細(xì)胞皺縮變圓時(shí)加入1ml 10%血清M199培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打皿內(nèi)溶液使貼壁細(xì)胞懸浮，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，2000r／min離心5min，棄上清液，加適量的10%血清M199培養(yǎng)液吹打混勻成細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以1×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔總培養(yǎng)液為100μL），置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

小鼠前體脂肪細(xì)胞的鑒定參照屈長(zhǎng)青等文章［5，6］，臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞存活率，然后以1×105個(gè)／ml的密度將細(xì)胞接種于事先鋪有蓋玻片的60mm培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱（37℃，飽和濕度，5%CO2）培養(yǎng)，24h后換液，以除去未貼壁的細(xì)胞，之后每2-3天 換1次液。培養(yǎng)8d后取出細(xì)胞爬片，進(jìn)行油紅0染色鑒定。

3.4 MTT法檢測(cè)前體脂肪細(xì)胞增殖情況

細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板中接種培養(yǎng)1d后，單層覆蓋率可達(dá)50%左右，吸棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，各孔分別加入不同濃度的益母草水提物配制的培養(yǎng)液100μl，其中每種濃度均加3個(gè)孔，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。2d后，每孔分別加入15μl MTT溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄孔內(nèi)溶液，使培養(yǎng)進(jìn)程終止，每孔再分別加入150μlDMSO溶液，將96孔板置于微孔振蕩器上振蕩10min使結(jié)晶物充分溶解，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490nm處測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求取各組平均值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率（%）＝（對(duì)照組OD值-給藥組OD值）／對(duì)照組OD值×100%［4］，其中不加益母草水提物的培養(yǎng)液所在的孔為對(duì)照組，其他各孔為給藥組。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差分析采用 LSD法，組間比較P＜0.05表示差異顯著。

結(jié) 果

MTT法是一種被普遍采用的間接反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量的方法，MTT比色結(jié)果見(jiàn)下表。

表1 MTT比色結(jié)果（ˉx±s）Table 1 Result of MTT（ˉx±s）

從上表可以看出：隨著益母草水提物濃度的逐漸增大，OD值呈明顯下降趨勢(shì)，即活細(xì)胞數(shù)目越來(lái)越少。

圖1 不同濃度益母草水提物對(duì)小鼠前體脂肪細(xì)胞的增殖抑制率Fig.1 Inhibition rates of different AMEH concentration on mice preadipocytes

從上圖抑制曲線可以看出：益母草水提物對(duì)前體脂肪細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，并且抑制率的大小取決于益母草的濃度。0mg／ml到1.5mg／ml濃度范圍內(nèi)，前體脂肪細(xì)胞的增殖明顯受到抑制；濃度在2.0mg／ml到2.5mg／ml范圍內(nèi)的益母草水提物對(duì)前體脂肪細(xì)胞的抑制效果維持一定水平，當(dāng)濃度增大到3.0mg／ml時(shí)，抑制曲線又呈現(xiàn)出明顯上升的趨勢(shì)。

討 論

一直以來(lái)，益母草主要是作為婦科藥被人們熟知，對(duì)于一些常見(jiàn)婦科病如原發(fā)性痛經(jīng)、乳腺增生癥等都有著很顯著的治療效果。除此之外，益母草在溶解血栓、降低血液黏度、降低血脂等諸多方面的藥用價(jià)值也逐漸被發(fā)現(xiàn)。隨著研究的不斷深入，益母草的藥用價(jià)值越來(lái)越顯著，然而有關(guān)益母草能否抑制脂肪細(xì)胞增殖方面的研究仍比較少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)益母草水提物對(duì)前體脂肪細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，并且呈現(xiàn)濃度依賴性，隨濃度升高，在1.5mg／ml至2.5mg／ml時(shí)，會(huì)維持一定的水平，但具體哪種物質(zhì)通過(guò)何種機(jī)制抑制脂肪細(xì)胞增殖還無(wú)從得知，而當(dāng)濃度增大到2.5mg／ml以上濃度時(shí)，益母草水提物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒害作用，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的目的，這些問(wèn)題都有待于進(jìn)一步的研究和論證。

［1］劉學(xué)哲.肥胖的研究現(xiàn)狀與展望.體育科技文獻(xiàn)通報(bào)，2009，17（2）：113-114

［2］顧月麗，顧江紅.益母草藥理作用的研究進(jìn)展.中國(guó)中醫(yī)院科技，2008，15（4）：320-321

［3］嚴(yán)優(yōu)芍.益母草不同提取方法的比較研究.中醫(yī)院導(dǎo)報(bào)，2010，16（5）：109-110

［4］宋霏.益母草提取物抗癌研究.實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2010，10（4）：82-83

［5］屈長(zhǎng)青，李東偉，朱茂英.一種改進(jìn)的培養(yǎng)脂肪細(xì)胞染色法.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2008，13（3）：329-330

［6］屈長(zhǎng)青，張國(guó)華，陳粉粉，等.豬前體脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng).農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，13（5）：649-653

Effect of aqueous extract of motherwort herb on proliferation of mice preadipocytes in vitro

Qu Changqing1，2＊，Xu Yanhua1，Dai Xiangxiang1
（1Fuyang Normal College of Life Sciences，AnHui，China；2Engineering Technology Research Center of Anti-aging Chinese Herbal Medicine，F(xiàn)uyang236041，China）

Objective To explore the influence of different concentrations of the aqueous extract from Motherwort Herb（AEMH）on the proliferation of mouse preadipocytes in vitro.Methods After treating the cells with AEMH at various concentrations（1.0-3.0mg／mL）for 24h，the proliferation rate of mouse preadipocytes was detected with MTT method.Results AEMH inhibited the proliferation of preadipocytes in a dose-dependent manner.Conclusion AEMH can significantly inhibites the proliferation of mouse preadipocytes in vitro.

AEMH；Mouse；Preadipocyte；Proliferation inhibition

R349.5

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.016

2011-06-14

2011-10-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助（31172182）；安徽省教育廳自然科學(xué)研究資助項(xiàng)目（KJ2011B127）

屈長(zhǎng)青，男（1972年），漢族，副教授。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）