武世伍 承澤農(nóng) 俞 嵐 宋文慶 陶儀聲

p16和Ki67在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

武世伍 承澤農(nóng) 俞 嵐 宋文慶 陶儀聲＊

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科；蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 安徽233003）

目的 探討p16和 Ki67在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的表達(dá)，研究它們對(duì) NSCLC患者預(yù)后的影響及其與臨床及病理因素之間的關(guān)系。方法 收集NSCLC術(shù)后標(biāo)本160例及正常肺組織20例（對(duì)照組），應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)NSCLC組織和正常肺組織中p16和Ki67的表達(dá)。結(jié)果 在NSCLC組織和正常肺組織中，p16和Ki67的陽(yáng)性表達(dá)率分別為23.8%、82.5%和90%、5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。多因素分析：PTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、p16及Ki67的表達(dá)是影響NSCLC根治術(shù)后患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P＜0.05）；p16陽(yáng)性組與陰性組5年生存率分別為55.3%和18.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ki67陽(yáng)性組與陰性組5年生存率分別為23.5%和42.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），p16和Ki67表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論 p16和Ki67參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展，p16和Ki67的表達(dá)水平與NSCLC的發(fā)展及預(yù)后有一定的關(guān)系。

非小細(xì)胞肺癌；p16；Ki67；預(yù)后

原發(fā)性肺癌無(wú)論其發(fā)病率和死亡率均增長(zhǎng)很快，逐漸成為人類頭號(hào)殺手［1-3］，其中約85%為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer NSCLC）［4］。p16基因是1994年被克隆的一個(gè)基因，又稱為多腫瘤抑制基因1（multiple tumor suppressor MTS1），后被人類基因組織正式命名為CDKN2（cyclin dependent kinase inhibitor 2）。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞系中p16基因缺失率達(dá)80%以上，在實(shí)體瘤中可達(dá)70%左右，其編碼的產(chǎn)物p16蛋白既是細(xì)胞周期有效調(diào)控者，又是抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子。Ki67是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，與腫瘤的增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后密切相關(guān)。本研究通過(guò)檢測(cè)160例NSCLC病例標(biāo)本p16和Ki67的表達(dá)，探討p16和Ki67與NSCLC患者的預(yù)后關(guān)系及其與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤局部浸潤(rùn)等因素的關(guān)系。

材料和方法

1.一般資料

收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2003年1月-2005年4月存檔石蠟包埋NSCLC組織標(biāo)本160例（術(shù)前未行放、化療）和正常肺組織標(biāo)本20例，所有病例均有完整的臨床、病理及隨訪資料，入選病例隨訪至患者死亡或截止2010年4月，隨訪時(shí)間為3-84個(gè)月。其中男性130例，女性30例；從大體類型看，中央型120例，周圍型40例；鱗癌116例（高分化17例，中分化71例，低分化28例），腺癌44例（高分化4例，中分化32例，低分化8例）。年齡26-82歲，中位年齡59.6±9.5歲，≥60歲86例，＜60歲74例；腫瘤長(zhǎng)徑 D≥3.0cm 145例，D＜3.0cm 15例；按淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移，有轉(zhuǎn)移76例，無(wú)轉(zhuǎn)移84例。根據(jù)UICC2002版PTNM病理分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中Ⅰ期患者31例，Ⅱ期患者43例，Ⅲ期患者34例，Ⅳ期患者52例。

對(duì)照組正常肺組織20例取自肺癌腫塊旁＞5.0cm的肺組織，病理HE染色證實(shí)為正常肺組織。

2.試劑

鼠抗人p16／MTS1單克隆抗體（產(chǎn)品編號(hào)：MAB-0223，克隆號(hào)：J8），鼠抗人 Ki67antigen單克隆抗體（產(chǎn)品編號(hào)：MAB-0129，克隆號(hào)：MIB-1）。ElivisionTM plus試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

3.實(shí)驗(yàn)方法

采用免疫組織化學(xué)ElivisionTM plus法，將石蠟標(biāo)本以4μm厚連續(xù)切片，烤干，于二甲苯溶液及不同濃度的乙醇中脫蠟至水洗。免疫組化染色操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用已知陽(yáng)性片作對(duì)照，以PBS液代替一抗作空白對(duì)照。

4.結(jié)果判定

p16在NSCLC組織中主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，Ki67蛋白在NSCLC組織細(xì)胞中表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，為黃色或棕黃色顆粒。采取二次計(jì)分法：每例標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比并計(jì)分。按染色強(qiáng)度計(jì)分：0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再將陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分，0分為陰性，1分為陽(yáng)性細(xì)胞＜10%，2分為11%-50%，3分為51%-75%，4分為＞75%。用染色強(qiáng)度得分和細(xì)胞數(shù)得分的乘積作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，若積分≤1為陰性，＞1為陽(yáng)性。免疫組化結(jié)果由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法讀片評(píng)定。

5.統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。p16和Ki67表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組生存分析用Kaplan-Meier法，組間比較用log-rank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox回歸多因素模型，p16和Ki67在NSCLC組織中表達(dá)與正常肺組織、各臨床及病理因素的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.p16和Ki67在NSCLC中的表達(dá)

p16在NSCLC組織中主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，Ki67蛋白在NSCLC組織細(xì)胞中表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，為黃色或棕黃色顆粒，表達(dá)率分別為23.8%（38／160）和82.5%（132／160）（圖1），正常肺上皮組織中的表達(dá)率分別為90%（18／20）和（1／20）5%。p16和Ki67在NSCLC組與對(duì)照組間均有顯著性差異（P＜0.05）。另外，Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)p16的表達(dá)與Ki67的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001）（表1）。

2.多因素分析

將病理組織分化（分為低分化組、中分化組與高分化組）、年齡（分為≥60歲組與＜60歲組）、PTNM分期（分為ⅠⅡ期組與Ⅲ Ⅳ期組）、腫瘤直徑（分為≥3.0cm組與＜3.0cm組）、腫瘤位置（分為中央型組與周圍型組）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（分為有轉(zhuǎn)移組與無(wú)轉(zhuǎn)移組）、性別（男性組與女性組）、p16（分為表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組）和Ki67（分為表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組）等因素引入Cox模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示：p16和Ki67的表達(dá)、PTNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立因素（表2）。

3.生存分析

本組病例總的5年生存率為26.9%。Kaplan-Meier生存分析顯示p16陽(yáng)性組與陰性組5年生存率分別為55.3%和18.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；Ki67陽(yáng)性組與陰性組5年生存率分別為23.5%和42.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖2、圖3）。

圖1 p16及Ki67在NSCLC組織中的表達(dá)A：NSCLC中p16表達(dá)陽(yáng)性，主要表達(dá)于細(xì)胞核（A為低分化鱗癌ElivisionTM×400）；B：NSCLC中Ki67表達(dá)陽(yáng)性，主要表達(dá)與細(xì)胞核（B為中分化鱗癌，ElivisionTM×400）。Fig.1 Expression of p16and Ki67in NSCLC （ElivisionTM×400）A：positive staining of p16in the nuclei of NSCLC（A is poor grading squamous carcinoma）；B：positive staining of Ki67in the nuclei of NSCLC （B is mediate grading squamous carcinoma）.

圖2 p16表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組NSCLC患者生存曲線Fig．2 Survival curves of NSCLC patients with positive or negative p16expression圖3 Ki67表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組NSCLC患者生存曲線Fig．3 Survival curves of NSCLC patients with positive or negative Ki67expression

圖2 p16表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組NSCLC患者生存曲線Fig．2 Survival curves of NSCLC patients with positive or negative p16expression圖3 Ki67表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組NSCLC患者生存曲線Fig．3 Survival curves of NSCLC patients with positive or negative Ki67expression

4.p16和Ki67表達(dá)與各臨床病理因素的關(guān)系p16的表達(dá)與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及PTNM分期等有關(guān)（P＜0.05），即p16表達(dá)越高，腫瘤的分化好、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移少以及PTNM分期早；而Ki67的表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及PTNM分期等有關(guān)（P＜0.05），即Ki67的表達(dá)越高，分化越差、越易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期越晚（見表3）。

表1 p16、Ki67在NSCLC和正常肺組織中的表達(dá)Table 1 Expression of p16and Ki67in NSCLC and Normal lung tissue

表2 160例NSCLC患者多因素分析Table 2 Multivariate survival analysis of 160patients with non-small cell lung cancer

表3 160例NSCLC組織p16和Ki67的表達(dá)與臨床、病理因素的關(guān)系Table 3 Correlation of p16and Ki67expression to clinicopathologic characteristics of 160patients with NSCLC

討 論

p16／MTS1基因定位于人類染色體9p21位置，全長(zhǎng)8.5kb，編碼一種細(xì)胞周期素依賴性激酶（CDK4）的抑制蛋白，即p16。p16既是細(xì)胞周期有效調(diào)控者，又是抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子。p16與cyclinD競(jìng)爭(zhēng)與CDK4結(jié)合，從而阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用。研究顯示，作為一種重要的抑癌基因，其失活與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，如黑色素瘤、肝癌、肺癌、食管癌、胰腺癌等腫瘤中都檢測(cè)到p16基因的失活，提示p16基因異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要事件。導(dǎo)致p16基因失活的原因有：（1）基因缺失；（2）基因突變；（3）甲基化。當(dāng)p16基因異常而不能正常表達(dá)時(shí)，cyclinD則與CDK4優(yōu)勢(shì)結(jié)合，細(xì)胞生長(zhǎng)失去控制，使細(xì)胞獲得無(wú)限增殖的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中p16的表達(dá)顯著低于癌旁正常肺組織，表明肺癌組織中存在p16蛋白的缺失，這與張軍航等［5］的研究結(jié)果一致，提示肺癌的發(fā)生可能與p16基因表達(dá)產(chǎn)物異常有關(guān)。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，p16蛋白在肺癌組織中表達(dá)水平與細(xì)胞分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。細(xì)胞分化越差，p16的表達(dá)越低；臨床分期越高，p16的表達(dá)越低；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率（13.2%）明顯低于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例（33.3%）。此結(jié)果表明隨著肺癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及向晚期發(fā)展，p16的表達(dá)率越來(lái)越低，提示p16基因異常是腫瘤發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要事件［6］。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)p16基因蛋白表達(dá)與NSCLC的組織類型、腫瘤大小、位置、發(fā)病年齡及性別等無(wú)關(guān)。

Ki67是與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，僅分布于核內(nèi)，位于10號(hào)染色體上。其表達(dá)出現(xiàn)于G1中期到晚期，S期和G2期逐漸增加，有絲分裂期達(dá)高峰，然后在有絲分裂期后迅速下降［7］。Ki67蛋白的表達(dá)水平可反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性，僅在增殖細(xì)胞中表達(dá)。Ki67高表達(dá)是細(xì)胞增殖活躍的重要標(biāo)志，因此與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)［8-9］。本研究顯示Ki67在NSCLC中的表達(dá)率顯著高于正常肺組織，說(shuō)明NSCLC的形成與細(xì)胞的異常增殖有關(guān)，且Ki67的表達(dá)率隨著NSCLC臨床分期的增加以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移而顯著增高，Ki67表達(dá)水平高者易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說(shuō)明Ki67與NSCLC的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。研究結(jié)果還顯示Ki67的表達(dá)與患者的年齡、腫瘤大小、組織學(xué)類型等無(wú)關(guān)。本研究多因素分析顯示p16和Ki67的表達(dá)情況、PTNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是影響NSCLC獨(dú)立預(yù)后因素。進(jìn)一步的生存分析顯示p16陽(yáng)性組與陰性組的5年生存率分別為55.3%和18.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示p16蛋白表達(dá)陽(yáng)性的NSCLC患者術(shù)后生存時(shí)間比較長(zhǎng)，比p16表達(dá)陰性者預(yù)后好，這與其它學(xué)者［10-11］的研究結(jié)果相一致，因此檢測(cè)p16蛋白的表達(dá)可作為判斷NSCLC預(yù)后的指標(biāo)。Ki67陽(yáng)性組與陰性組的5年生存率分別為23.5%和42.9%，差異具有顯著性，即Ki67陽(yáng)性表達(dá)組生存時(shí)間低于陰性表達(dá)組，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相同［12］。

本研究對(duì)NSCLC中p16蛋白、Ki67抗原的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)癌組織中隨著Ki67陽(yáng)性表達(dá)率的升高，p16表達(dá)率顯著降低，兩者呈負(fù)相關(guān)。提示p16蛋白的表達(dá)與癌細(xì)胞增殖指數(shù)可能存在一定聯(lián)系，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)p16蛋白表達(dá)降低時(shí)，cyclinD則與CDK4優(yōu)勢(shì)結(jié)合，刺激細(xì)胞旺盛分裂，細(xì)胞獲得無(wú)限增殖的能力，使Ki67核抗原表達(dá)增多，最終使細(xì)胞失去控制，并向癌變發(fā)展。表明p16和Ki67參與了NSCLC的發(fā)生，且p16表達(dá)缺失和Ki67指數(shù)高的腫瘤分裂增殖快、易轉(zhuǎn)移和預(yù)后差，因此，p16和Ki67表達(dá)對(duì)NSCLC術(shù)后轉(zhuǎn)移、生存率及生存期預(yù)后的估計(jì)可能有一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述，p16蛋白和Ki67抗原在肺癌中的研究有著廣闊的前景，其不僅在肺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，而且對(duì)肺癌患者的預(yù)后有一定的估計(jì)價(jià)值。相信隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，p16和Ki67基因會(huì)成為肺癌進(jìn)行基因治療的靶基因。

［1］Belani CP，Liao J.Maintenance therapy for non-small cell lung cancer.Lancet，2010，375（9711）：281-282

［2］Dahlberg SE，Sandler AB，Brahmer JR，et al.Clinical course of advanced non-small cell lung cancer patients experiencing hypertension during treatment with bevacizumab in combination with carboplatin and paclitaxel on ECOG 4599.J Clin Oncol，2010，28（6）：949-954

［3］Jemal A，Center MM，Desantis C，et al.Global patterns of cancer incidence and mortality rates and trends.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.2010，19（8）：1893-1907

［4］Suresh S，Ramalingam，MD，Taofeek K，et al.Lung cancer：new biological insights and recent therapeutic advances.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：91-112

［5］張軍航，馬琳，劉芙蓉，等.肺癌組織中p16基因mRNA的表達(dá)及其臨床意義.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2004，21（4）：464-465

［6］Geradt SJ，Ingram CD.Abnormal expression of cell cycle regulatory proteins inductal and lobular carcinomas of the breast.Mod Pat Hol，2000，13（9）：945-953

［7］劉鵬熙，陳前軍，鐘少文，等.新輔助化療對(duì)乳腺癌P170、Ki67、P53的影響.腫瘤，2006，26（2）：168

［8］Gentile V，Vicini P，Gicaomenlli，et al.Detection of human papillomavirus DNA，p53and ki67expression in penile carcinomas.Int J Immunopathol Pharmacol，2006，19（1）：209-215

［9］Jalava P，Kuopio T，Juntti-Patinen L，et al.Ki67immunohistochemistry：a valuable marker in prognostication but with a risk of misclassification：proliferation subgroups formed based on Ki67immunoreactivity and standardized mitotic index.Histopathology，2006，48（6）：674-682

［10］Jin M，Inoue S ，Umemura T，et al.CyclinD1，p16 and retinoblastoma gene product expression as a predict or for prognosis in non-small cell lung cancer at stagesⅠandⅡ.Lung Cancer，2001，34（2）：207-218

［11］Gessner C，Liebers U，Kuhn H，et al.BAX and p16 INK4aare independent positive prognostic markers for advanced tumour stage of non-small cell lung cancer.Eur Respir J，2002，19（1）：134-140

［12］Carlos VJ，Herrero ZA，F(xiàn)resno MF，et al.Expression of cyclin D1and Ki-67in squamous cell carcinoma of the oral cavity：clinicopathological and prognostic significance.Oral Oncol，2002，38（3）：301-308

Expression of p16and Ki67and their correlation with prognosis in non-small cell lung cancer

Wu Shiwu，Cheng Zenong，Yu Lan，Song Wenqing，Tao Yisheng＊
（Department of Pathology，Bengbu Medical College，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Anhui 233000，China）

Objective To study the expression of p16and Ki67in non-small cell lung cancer（NSCLC），and explore their correlation with prognosis and chinicopathologic factors of NSCLC.Methods The expression of p16and Ki67proteins in 160specimens of NSCLC and 20normal lung tissue was detected by immunohistochemistry.Results The positive rates of p16and Ki67proteins in NSCLC were 23.8%and 82.5%respectively，but 90%and 5%in normal lung tissue.There was a significant difference between the two （P＜0.05）.There was a negative correlation between the expression of p16and that of Ki67in NSCLC.PTNM staging、lymph node metastasis and positive expression of p16and Ki67were independent prognosis factors of NSCLC （P＜0.05）.The five-year survival rate was significantly different between the p16-positive and p16-negative group （55.3%vs 18.0%），and between the Ki67-negative and Ki67-positive groups（42.9%vs 23.5%）.Conclusion Ki67and p16may be involved in the initiation and development of NSCLC，and the level of p16and Ki67is correlated to the progression and prognosis of NSCLC.

Non-small cell lung cancer；p16；Ki67；Prognosis

R734.2

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.014

2011-06-21

2011-09-20

武世伍，男（1977年），漢族，碩士。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）