張 建 陳 穗 羅學(xué)勝＊ 楊 忠 李紅麗 蔡文琴

Wnt信號分子在神經(jīng)管缺陷（NTD）發(fā)生過程中的表達(dá)及其可能的作用機(jī)制

張 建1陳 穗1羅學(xué)勝1＊楊 忠2李紅麗2蔡文琴2

（1寧波市解放軍第113醫(yī)院干部病房，寧波315040；2重慶市第三軍醫(yī)大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，重慶400038）

目的 探討Wnt信號分子在神經(jīng)胚形成和神經(jīng)管缺陷（NTD）發(fā)生過程中的作用及其可能的分子調(diào)控機(jī)制。方法 用Western blot方法半定量檢測正常及NTD小鼠胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織中Wnt信號分子的變化。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測正常和神經(jīng)管缺陷（NTD）胚胎腦泡及脊髓神經(jīng)組織神經(jīng)上皮細(xì)胞周期動力學(xué)的變化。結(jié)果 與正常胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織比較，NTD胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織的β-catenin蛋白表達(dá)量明顯減弱；而GSK-3β蛋白表達(dá)量明顯增強(qiáng)。流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果顯示：與正常E10.5d胚胎腦泡及脊髓神經(jīng)組織的神經(jīng)上皮相比，神經(jīng)管缺陷模型胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織的神經(jīng)上皮細(xì)胞處于G0／G1期的細(xì)胞百分比明顯增高，而神經(jīng)上皮細(xì)胞處于S期的細(xì)胞百分比則明顯降低。結(jié)論神經(jīng)管缺陷的發(fā)生與Wnt信號途徑的變化是密切相關(guān)的，Wnt信號分子的變化可能正是神經(jīng)管缺陷形成中細(xì)胞增殖抑制的相關(guān)分子機(jī)制。神經(jīng)管上皮細(xì)胞的增殖抑制及凋亡可能是NTD發(fā)生的重要細(xì)胞基礎(chǔ)。

Wnt信號分子；神經(jīng)管缺陷；Western blot；流式細(xì)胞技術(shù)；小鼠

Wnt信號通路是調(diào)控細(xì)胞生長增殖的關(guān)鍵途徑，在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中起著重要作用。βcatenin是經(jīng)典Wnt通路中關(guān)鍵的胞內(nèi)效應(yīng)分子，它進(jìn)入細(xì)胞核后通過與LEF／TCF家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控特定基因的表達(dá)［1］。β-catenin在胞內(nèi)主要受 APC-Axin-GSK-3β多蛋白復(fù)合體的調(diào)制；其中GSK-3β即糖原合酶激酶3β的主要作用是使游離的β-catenin磷酸化，使其進(jìn)入泛素-蛋白酶體系統(tǒng)而被降解，Wnt蛋白等即通過對GSK-3β等的抑制，引起胞漿內(nèi)游離β-catenin的升高而激活該途徑［2］。神經(jīng)管形成是一個多因素參與的非常復(fù)雜的胚胎學(xué)事件，其中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)差錯，都可能導(dǎo)致神經(jīng)管缺陷（neural tube defect，NTD）的發(fā)生［3］。采用喂服維甲酸誘導(dǎo)孕小鼠發(fā)生NTD已有較多的研究［4］；此外還有甲醇、丙戊酸（VPA）等引起神經(jīng)管缺陷模型的報道，本實驗依據(jù)小鼠母體攝入致畸物后其毒性具有發(fā)育時相敏感性的特點，采用孕7.5天小鼠腹腔注射甲醇的方法制備神經(jīng)管缺陷模型［5］，獲得了比較穩(wěn)定的結(jié)果。神經(jīng)管關(guān)閉的整個過程又稱為神經(jīng)胚形成（neurulation），對神經(jīng)胚形成的細(xì)胞、組織、特別是分子機(jī)制的研究是當(dāng)今發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)的一個熱點領(lǐng)域。神經(jīng)上皮中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖遷移及分化是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。神經(jīng)管缺陷就是其中發(fā)生率最高的一種，表現(xiàn)為脊柱裂、腦暴露、無腦、卷尾或無尾等。多年來的研究提示NTD的發(fā)生與神經(jīng)上皮的異常發(fā)育密切相關(guān)。許多研究認(rèn)為NTD的發(fā)生主要是神經(jīng)嵴細(xì)胞或神經(jīng)管腹側(cè)細(xì)胞過度凋亡所致［6，7］。而 Wnt信號分子可以控制神經(jīng)前體細(xì)胞的生長以及細(xì)胞增殖與分化的平衡［8］，因此，Wnt信號通路分子與NTD的發(fā)生可能也存在密切的關(guān)系。本實驗用小鼠作為實驗對象，旨在為哺乳動物神經(jīng)管發(fā)生階段Wnt信號分子的表達(dá)研究提供有價值的資料，對于探討Wnt信號分子在正常神經(jīng)管關(guān)閉和NTD發(fā)生過程中的作用和及其可能的分子調(diào)控機(jī)制具有重要的意義。

材料和方法

1.實驗動物

成年昆明種小鼠30只（雌性小鼠20只，雄性小鼠10只，體質(zhì)量平均為25g），由第三軍醫(yī)大學(xué)校動物中心提供。

2.主要試劑

β-catenin、GSK-3β多克隆抗體（兔血清）為美國SANTA CRUZ公司產(chǎn)品，Western Blot使用二抗是武漢博士德公司生產(chǎn)的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG。無水甲醇購自上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司。多聚甲醛購自于美國Sigma公司。

3.模型制備

成年昆明種小鼠于下午18：00按雌雄1：1合籠（雌性小鼠20只，雄性小鼠10只），次日晨8：00取出，檢查雌鼠的陰道口有無陰栓，有陰栓存在表示有過交配行為，一共獲得孕鼠17只。將發(fā)現(xiàn)陰栓者的當(dāng)天早晨8：00定為孕期第0天（E0d），下午16：00定為E0.5d。將其中10只按1.5g／kg甲醇于孕期E7.0d-7.25d時腹腔注射孕鼠，可造成NTD模型，剩余7只孕鼠作為正常對照組。

4.標(biāo)本采集

在孕期為E10.5d時，在4倍解剖顯微鏡下確定已造成NTD發(fā)生，一共取得合格胎鼠模型42只（甲醇誘導(dǎo)NTD模型成功率達(dá)75%左右）。其中的21只鼠胚在分離胎盤、胎膜組織后，對鼠胚進(jìn)行形態(tài)學(xué)辨別篩選，檢查每個胚胎頭部、面部、脊柱、尾部等發(fā)育的外觀特征后，獲得各階段腦泡及脊髓神經(jīng)組織，制備單細(xì)胞懸液。將制備好的細(xì)胞懸液用75%乙醇4℃固定，備用。同上述方法，一共取得孕期正常胚胎15只。

5.胚胎組織蛋白的提取

將孕期正常15只胚胎及上述所獲剩余21只NTD胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織標(biāo)本置于1.5mlEP管中。將EP管在液氮中冷凍15min后取出，繼續(xù)用吸管吹打胚胎組織。按照3ml／g組織的RIPA緩沖液，30μl／g組織的PMSF緩沖液加入EP管中，繼續(xù)用吸管吹打胚胎組織。EP管最好在冰里吹打，溫度保持在4℃。將EP管置于冰塊中冷凍30min。冰凍離心機(jī)15000轉(zhuǎn)／min，4℃，15min離心。上清液分裝于-20℃保存。

6.Western blot

分別取孕期正常胚胎組及NTD胚胎組10μl蛋白質(zhì)加入等體積10μl上樣緩沖液混勻，100℃一起煮沸5min變性；冷卻后上樣于10%SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，然后電轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液沖洗，4℃孵育過夜，PVDF膜在室溫下與一抗β-catenin抗體（1∶2000）、GSK-3β（1∶1000）孵育1h，漂洗后入生物素化二抗（1∶2000）室溫下孵育1h，每次孵育之間均用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min，DAB顯色后于凝膠成像系統(tǒng)上成像記錄，然后用圖像分析軟件測定所采集的圖像目的條帶的負(fù)相關(guān)密度。實驗重復(fù)三次，蛋白表達(dá)定量水平用目的條帶的負(fù)相關(guān)密度值表示。

7.流式細(xì)胞術(shù)

將收集的各組細(xì)胞機(jī)械吹打制成細(xì)胞懸液，體積分?jǐn)?shù)為0.70的乙醇固定，4℃過夜。0.01mol／L濃度PBS洗滌離心。20μl的0.125%胰酶37℃水浴5min，4℃避光保存30min。激發(fā)波長488nm的激光檢測，Cell fit軟件收集細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞周期分析，每組5例標(biāo)本，每個標(biāo)本檢測1×104個細(xì)胞，測定各細(xì)胞周期所占百分比。

8.統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包中t檢驗以及χ2進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。

結(jié) 果

1.正常及甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的NTD鼠胚的大體形態(tài)觀察

本實驗中正常孕鼠的胚胎數(shù)均在8-16個，母鼠子宮無充血。解剖顯微鏡下觀察到各階段鼠胚多為活胎，死胎偶爾可見。E9.5d時，胚體已經(jīng)完成轉(zhuǎn)體，神經(jīng)管絕大部分閉合，僅有尾部后神經(jīng)孔尚未閉合（至E9.75d才能完全閉合）；至E10.5d，神經(jīng)管完全關(guān)閉，胚胎進(jìn)一步發(fā)育，外觀飽滿、表面圓滑；腮弓清晰（3對）；眼泡、耳泡可見；脊柱表面完整無裂口；尾部細(xì)長彎曲；前后肢芽出現(xiàn)；25-30對體節(jié)（圖片3、5）。

腹腔注射甲醇后孕鼠在E8.5d-E10.5d?？梢娒黠@的子宮充血淤血。E11.5d以后的孕鼠子宮多恢復(fù)正常狀態(tài)。解剖顯微鏡下觀察到：與正常對照組相比，E9.5-10.5d時胚胎形態(tài)多樣，主要為前腦頂部和后腦未閉合，在少數(shù)胚胎可發(fā)現(xiàn)整個神經(jīng)管未閉合，呈開放狀態(tài)。在 E9.5d-E11.5d可見多種表現(xiàn)形態(tài)的鼠胚畸形，包括顱腦頂部未閉合呈現(xiàn)裂口、后腦及面部異常、脊柱或尾部有裂口、及顱腦正常伴無尾或短尾等等畸形（圖片4、6）。

2.正常及NTD胚胎神經(jīng)組織的細(xì)胞周期動力學(xué)的檢測結(jié)果

流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果顯示：與正常E10.5d胚胎腦泡及脊髓神經(jīng)組織的神經(jīng)上皮相比，神經(jīng)管缺陷模型胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織的神經(jīng)上皮細(xì)胞處于G0／G1期的細(xì)胞百分比明顯增高，而神經(jīng)上皮細(xì)胞處于S期的細(xì)胞百分比則明顯降低，經(jīng)對多次檢測結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析，兩組存在顯著性差異（P＜0.01）。正常及NTD胚胎神經(jīng)組織的細(xì)胞周期各期百分率見表1。圖1為單次流式細(xì)胞儀檢測正常胚胎神經(jīng)上皮組織的細(xì)胞周期動力學(xué)結(jié)果圖像。

表1 正常及NTD組E9.5-10.5d鼠胚神經(jīng)組織細(xì)胞周期各期百分率（ˉx±s%，n＝5）Table 1The percentage of different cell phase of nerve tissues from the normal and NTD mouse embryoon gestational 9.5-10.5days.

3.正常及NTD鼠胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織中Wnt信號分子的表達(dá)變化

Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常與NTD胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織中均有β-catenin、GSK-3β蛋白的表達(dá)。3次蛋白來自不同組別的檢測結(jié)果顯示：與正常胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織比較，NTD胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織的β-catenin蛋白條帶表達(dá)明顯減弱；而GSK-3β蛋白條帶表達(dá)明顯增強(qiáng)。（圖片1、2）。表明與正常胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織比較，由甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的NTD鼠胚腦泡及脊髓神經(jīng)組織中β-catenin蛋白的定量分析結(jié)果顯示，βcatenin蛋白在NTD鼠胚腦泡及脊髓神經(jīng)組織中表達(dá)量下降了67.80%，經(jīng)統(tǒng)計處理顯示明顯差異（P＜0.05）。與正常胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織比較，由甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的NTD鼠胚腦泡及脊髓神經(jīng)組織中GSK-3β蛋白的定量分析結(jié)果顯示，GSK-3β蛋白在NTD鼠胚腦泡及脊髓神經(jīng)組織中表達(dá)量上升了82.60%，經(jīng)統(tǒng)計處理顯示有顯著性差異（P＜0.01）。正常與NTD小鼠胚胎的神經(jīng)組織中β-catenin、GSK-3β蛋白表達(dá)量差異的比較見圖2。

討 論

神經(jīng)管形成是一個多因素參與的非常復(fù)雜的胚胎學(xué)事件，其中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)差錯，都可能導(dǎo)致NTD的發(fā)生［9］。外源性維甲酸（retinoic acid，RA）是常見的致畸因子之一，體內(nèi)RA過多過少均可引起神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的畸形；采用喂服維甲酸誘導(dǎo)孕小鼠發(fā)生神經(jīng)管缺陷（neural tube defect，NTD）已有較多的研究［4，10］；此外還有甲醇、丙戊酸（VPA）等引起神經(jīng)管缺陷模型的報道，本實驗依據(jù)小鼠母體攝入致畸物后其毒性具有發(fā)育時相敏感性的特點，采用孕7.5天小鼠腹腔注射甲醇的方法制備神經(jīng)管缺陷模型［11］，獲得了比較穩(wěn)定的結(jié)果。

本實驗中流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果表明：NTD模型胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織與正常胚胎神經(jīng)組織比較，神經(jīng)上皮細(xì)胞存在明顯的G1期阻滯，細(xì)胞增殖能力下降；此外我們既往的研究還顯示NTD神經(jīng)組織中細(xì)胞大量發(fā)生凋亡［3］，提示神經(jīng)管上皮細(xì)胞的增殖抑制及凋亡可能是NTD發(fā)生的重要細(xì)胞基礎(chǔ)。

本實驗的結(jié)果還顯示正常神經(jīng)管組織中S期及G2／M期的細(xì)胞比例較高，提示神經(jīng)管上皮細(xì)胞處于較活躍的細(xì)胞周期；作為細(xì)胞增殖的最后共同通路，靜止期細(xì)胞在受到增殖原刺激后，從G0／G1期向S期、G2期及M期過渡，如果有增殖原的不斷刺激，細(xì)胞在經(jīng)過M期后進(jìn)入G1期并繼續(xù)下一個周期。如果失去增殖原刺激，細(xì)胞常即停止于G1期，不再向S期過渡而停止增殖。本實驗中甲醇通過對細(xì)胞周期的抑制，扮演了一個抑制細(xì)胞增殖的角色。與正常胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織的神經(jīng)上皮細(xì)胞相比，神經(jīng)管缺陷模型胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織的神經(jīng)上皮細(xì)胞處于G0／G1期細(xì)胞數(shù)百分比明顯增高（P＜0.01），同時，神經(jīng)上皮細(xì)胞處于S期細(xì)胞數(shù)百分比明顯降低（P＜0.01）。提示神經(jīng)管缺陷模型中的神經(jīng)上皮細(xì)胞出現(xiàn)了S期的阻滯，細(xì)胞增殖能力下降。

通過Western blot方法比較正常與NTD胚胎腦泡及脊髓神經(jīng)組織中Wnt信號分子的表達(dá)，本實驗的結(jié)果顯示：與正常胚胎比較，甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的NTD胚胎的腦泡及脊髓神經(jīng)組織中β-catenin蛋白表達(dá)量明顯減少，而GSK-3β表達(dá)量相對增多。結(jié)合流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果，可以認(rèn)為神經(jīng)管缺陷的發(fā)生與Wnt信號途徑的變化是密切相關(guān)的，Wnt信號分子的變化可能正是神經(jīng)管缺陷形成中細(xì)胞增殖抑制的相關(guān)分子機(jī)制。

目前研究已經(jīng)確定：在神經(jīng)板、神經(jīng)管頭尾模式的建立中，Wnt信號通路扮演了關(guān)鍵角色［12］。Bennett等的實驗發(fā)現(xiàn)，伴隨著Wnt信號通路的失調(diào)，在胚胎發(fā)育過程中常出現(xiàn)神經(jīng)胚形成的異常［13］。有報道在神經(jīng)管缺陷胚胎中Wnts基因是過表達(dá)的，研究認(rèn)為在神經(jīng)胚形成過程中神經(jīng)管內(nèi)Wnts表達(dá)水平的異常增高不僅過度活化了Wnts通路，同時由于部分β-catenin由胞膜的內(nèi)移可能削弱了細(xì)胞粘附能力，由此引起細(xì)胞粘附與極性等的異常而導(dǎo)致神經(jīng)胚形成缺陷［14］。本實驗進(jìn)一步論證了上述結(jié)論，表明Wnt信號分子的表達(dá)變化可能是NTD發(fā)生的機(jī)制，外環(huán)境可能是通過它們來發(fā)揮對神經(jīng)系統(tǒng)的致畸作用，但是這僅僅可能是NTD發(fā)生的機(jī)制之一，對這一復(fù)雜的過程還需要更多的研究。

此外Wilts等報道丙戊酸和曲古抑菌素A所致的神經(jīng)管缺陷可能也與它們對Wnt基因的作用有關(guān)，一些結(jié)構(gòu)類似的化合物因為不對Wnt基因起作用，而不會造成NTD的發(fā)生［10］。Wnt7a一直被作為是經(jīng)典Wnt信號通路的胞外信號分子，有研究顯示其對非經(jīng)典通路的細(xì)胞骨架構(gòu)建等過程也具有調(diào)節(jié)作用。目前可以肯定的是這一類的Wnt蛋白參與了胚胎發(fā)育中的神經(jīng)胚形成。而在最近國外的最新研究中顯示：通過阻斷經(jīng)典的 Wnt信號通路，可以顯著增加神經(jīng)前體細(xì)胞的數(shù)量，從而導(dǎo)致成熟的神經(jīng)元不能分化，胚胎軸線的延長不能完成，神經(jīng)管閉合受到抑制［15］。結(jié)合本課題的研究，再次證實有關(guān)研究的正確性，并提供了更多的實驗資料；同時提示W(wǎng)nt信號通路與神經(jīng)胚形成以及NTD的發(fā)生密切相關(guān)，其經(jīng)典通路中下游的關(guān)鍵信號因子β-catenin、GSK-3β就是通過調(diào)控神經(jīng)管前體細(xì)胞的增殖凋亡等過程，參與了甲醇誘導(dǎo)的NTD發(fā)生。

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圖 版 說 明

圖1 流式細(xì)胞儀檢測正常小鼠胚胎神經(jīng)上皮組織的細(xì)胞周期動力學(xué)數(shù)據(jù)

圖2 正常及NTD鼠胚神經(jīng)上皮組織中beta-catenin及GSK-3beta蛋白的平均光密度值比較

圖3 正常及NTD胚胎的神經(jīng)上皮組織的β-catenin Western blot分析

圖4 正常及NTD胚胎的神經(jīng)上皮組織的GSK-3βWestern blot分析

圖5 正常E11.5d鼠胚見頭部飽滿 （×2.6）

圖6 神經(jīng)管缺陷E11.5d鼠胚顱腦頂部未閉畸形 （×2.6）

圖7 正常E11.5d鼠胚見頭部飽滿 （×2.6）

圖8 神經(jīng)管缺陷E11.5d鼠胚面部異?；危ā?.6）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Flow cytometry detected The data of cell dynamic changes of the normal mouse embryo nerve tissues.

Fig.2 The comparative optical density ofβ-catenin protein and GSK-3βprotein in the normal and NTD mouse embryo nerve tissues.

Fig.3 The expression changes of wnt signaling moleculesβcatenin protein in the normal and NTD mouse embryo nerve tissues examined by using western blotting.

Fig.4 The expression changes of wnt signaling molecules GSK-3βprotein in the normal and NTD mouse embryo nerve tissues examined by using western blotting.

Fig.5 The normal mouse embryo at age of embryonic day 11.5（E10.5）×2.6

Fig.6 The CNS malformation at age of embryonic day 11.5（E11.5）included acrania，spina bifida and so on.×2.6

Fig.7The normal mouse embryo at age of embryonic day 11.5（E10.5）×2.6

Fig.8The CNS malformation at age of embryonic day 11.5（E11.5）included craniofacial abnormal and so on.×2.6

Expression and possible molecular mechanism of Wnt signaling in the process of neural tube defect

1Zhang Jian，1Chen Sui，2Yang Zhong，2Li Hongli，2Cai Wenqin
（Department of Geriatrics，The 113th Hospital of PLA ，Ningbo 315040；Department of histology and embrgology，The 3rd Miltary Medical University，Chongqing400038，China）

Objective To investigate the role and the possible molecular mechanism of Wnt signaling in the process of neural tube defect（NTD）.Methods Western blot was performed to detect the expression of Wnt signaling in the normal and NTD brain and spinal nerve tissue.By using flow cytometry，the cell dynamic changes of Wnt signaling in the normal and NTD brain and spinal nerve tissue was detected.Results In the NTD brain and spinal nerve tissue，the level ofβ-catenin decreased and GSK-3βincreased significantly as compared with those of the control groups.Flow cytometry showed that a higher proportion of G1phase cells existed in NTD mice than in the normal group at E10.5（P＜0.01）.and the percentage of S phase cells showed a significant decrease in the meantime.Conclusion Our results suggest that the wnt／β-catenin pathway may be involved in the process of NTD as well.The decreasedβ-catenin level caused by inhibition of this pathway may act as a molecular mechanism in the NTD process.

Wnt signaling；Neural tube defect（NTD）；Western blot；Flow cytometry；Mouse

R321.6

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.007

2011-05-25

2011-09-06

第三軍醫(yī)大學(xué)回國人員啟動基金

張建，男（1976年），漢族，主治醫(yī)師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）