張曉麗 趙舒武 王富武 邴魯軍 郝 晶＊

（1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，濟(jì)南250012；2天津中醫(yī)藥大學(xué)組胚教研室，天津300193）

人完全性葡萄胎中c-myc的表達(dá)及意義

張曉麗1趙舒武2王富武1邴魯軍1郝 晶1＊

（1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，濟(jì)南250012；2天津中醫(yī)藥大學(xué)組胚教研室，天津300193）

目的 研究c-myc基因在人完全性葡萄胎中的表達(dá)及其意義。方法 取人完全性葡萄胎30例，正常早孕流產(chǎn)標(biāo)本10例，用SABC免疫組織化學(xué)染色方法，檢測(cè)c-myc基因在兩種組織中的表達(dá)情況，并采用圖像分析技術(shù)，對(duì)正常早孕絨毛組和完全性葡萄胎組c-myc的表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果 與正常絨毛相比，c-myc基因在完全性葡萄胎組織中的表達(dá)量和表達(dá)的空間特異性有明顯不同。結(jié)論 c-myc基因可能與完全性葡萄胎的發(fā)生密切相關(guān)。

c-myc基因；完全性葡萄胎；正常胎盤(pán)絨毛；免疫組化

完全性葡萄胎是在胚胎發(fā)生過(guò)程中，由于胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度增生而形成的一種病理變化，以滋養(yǎng)層細(xì)胞異常增生、絨毛間質(zhì)水腫及間質(zhì)血管缺乏為主要特征。在某些方面，其生物學(xué)行為與腫瘤非常相似。在我國(guó)，發(fā)生率明顯高于歐美，因此研究某些癌基因在發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)對(duì)闡明完全性葡萄胎的發(fā)生機(jī)制有非常重要的意義。本研究采用敏感性高、特異性強(qiáng)且操作快速簡(jiǎn)便的免疫組織化學(xué)SABC方法，檢測(cè)了早期流產(chǎn)的正常胎盤(pán)絨毛和完全性葡萄胎組織中c-myc基因的表達(dá)情況，以探討c-myc基因的表達(dá)狀況與完全性葡萄胎發(fā)生的相關(guān)性。

材料和方法

1.材料

1.1 標(biāo)本來(lái)源 30例完全性葡萄胎均為臨床首次清宮組織，孕齡為6-16周不等；同時(shí)收集6-12周早孕人工流產(chǎn)絨毛標(biāo)本10例作為對(duì)照。標(biāo)本來(lái)源：山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、山東省立醫(yī)院和一些縣、市級(jí)醫(yī)院的婦產(chǎn)科病人，病理診斷為完全性葡萄胎。正常胎盤(pán)絨毛標(biāo)本取自山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院計(jì)劃生育門(mén)診刮宮流產(chǎn)病例。

1.2 試劑 鼠抗人c-myc單克隆抗體及SABC免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

2.方法

2.1 免疫組織化學(xué)染色 所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟切片7μm厚 ，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%H2O2封閉過(guò)氧化物酶，恒溫箱96℃-100℃20min進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加0.01mol／L pH7.4的PBS稀釋的c-myc一抗（1：100）4℃孵育過(guò)夜，陰性對(duì)照組以0.0lmol／L pH 7.4的PBS代替一抗。滴加0.01mol／L pH 7.4的PBS稀釋的二抗37℃孵育30min，最后室溫下DAB顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，至陰性對(duì)照將著色時(shí)為止。期間各步均以0.0lmol／L pH 7.4的PBS洗滌3次，每次5min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

2.2 顯色結(jié)果判定 c-myc基因免疫組化陽(yáng)性結(jié)果表現(xiàn)為滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，陰性對(duì)照不顯色。用彩色圖像分析系統(tǒng)對(duì)標(biāo)本中陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行定量分析：每張切片選10個(gè)高倍視野，每例共測(cè)10個(gè)細(xì)胞的陽(yáng)性信號(hào)灰度值。將圖像分析所得數(shù)據(jù)ˉx±s表示。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用spss統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

結(jié) 果

正常早孕胎盤(pán)絨毛及完全性葡萄胎均有c-myc基因的陽(yáng)性表達(dá)，定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀。劃分標(biāo)準(zhǔn)為：未著色為陰性（-），淺黃色著色為弱陽(yáng)性（＋），黃色著色為中度陽(yáng)性（＋＋），棕色著色為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋ ）。

1.早孕絨毛組織免疫組化染色結(jié)果 正常絨毛染色深淺不一，淺染絨毛合體滋養(yǎng)層為弱陽(yáng)性著色，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞為陽(yáng)性著色；深染絨毛中細(xì)胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層細(xì)胞均為強(qiáng)陽(yáng)性著色（圖1，2，3）。

2.完全性葡萄胎組織免疫組化染色結(jié)果 cmyc基因蛋白在完全性葡萄胎組織中所有絨毛染色類(lèi)型相同，無(wú)深染絨毛和淺染絨毛之分，但在細(xì)胞著色類(lèi)型上有差異：細(xì)胞滋養(yǎng)層和間質(zhì)呈陰性著色，合體滋養(yǎng)層細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性著色（圖4，5，6）。

3.圖像分析和統(tǒng)計(jì)結(jié)果 染色標(biāo)本經(jīng)圖像分析系統(tǒng)處理，方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，完全性葡萄胎組織細(xì)胞滋養(yǎng)層c-myc基因表達(dá)強(qiáng)度和正常絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞之間有差異（表1）；同時(shí)完全性葡萄胎合體滋養(yǎng)層細(xì)胞c-myc基因表達(dá)強(qiáng)度和正常絨毛中淺染絨毛中的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的表達(dá)也有明顯不同。

討 論

完全性葡萄胎是滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中最常見(jiàn)的一型，對(duì)其病因?qū)W和發(fā)病學(xué)的研究，迄今為止仍停留在假說(shuō)階段。劉麗君等研究了PCNA和Caspase3在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中的表達(dá)及意義表明PCNA和Caspase3表達(dá)異常和增殖／凋亡失衡是引起妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的重要因素［1］。

已有報(bào)道，c-myc mRNA水平在不同細(xì)胞周期時(shí)相有很大差別，其轉(zhuǎn)錄速率僅在由G0期進(jìn)入G1期時(shí)有較大程度的增高，而在其他細(xì)胞周期時(shí)相和細(xì)胞分化時(shí)均保持在大致相同的較低水平上［2～5］。

Pfeifer-Ohlsson［6］等發(fā)現(xiàn)，在人正常胎盤(pán)組織中，c-myc mRNA呈階段特異性表達(dá)，其在不同階段的表達(dá)水平可相差30倍；c-myc mRNA主要表達(dá)于細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞。這與我們的免疫組化結(jié)果相符。我們的免疫組化染色結(jié)果還顯示，c-myc基因在正常早孕絨毛組織中的染色深淺不一，可能是由于不同部位的絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞處于不同的細(xì)胞周期時(shí)相和分裂、分化階段；染色較深的細(xì)胞，提示其細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞可能分裂較活躍，而染色較淺的細(xì)胞，其分裂活性較低，或可能處于細(xì)胞間期或分化階段。

同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，完全性葡萄胎合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中c-myc癌基因蛋白的表達(dá)強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，而在正常胎盤(pán)組織中，合體滋養(yǎng)層細(xì)胞細(xì)胞c-myc的表達(dá)低于細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞。C-myc癌基因蛋白表達(dá)的這種細(xì)胞特異性是以往沒(méi)有報(bào)道過(guò)的，我們認(rèn)為這可能就是c-myc癌基因蛋白在合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致了完全性葡萄胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的異常增生。

C-myc基因在正常組織中是細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期演進(jìn)的一個(gè)正調(diào)控基因，也是調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因，其過(guò)度表達(dá)不僅可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和惡性分化，同時(shí)還可以抑制細(xì)胞的正常分化。在正常胚胎發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞是一種具有旺盛分裂增殖能力的細(xì)胞，其c-myc癌基因應(yīng)有較豐富的表達(dá)，我們的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，說(shuō)明c-myc基因確與細(xì)胞的增殖狀態(tài)有關(guān)。pfeifer-Ohlsson等［6］的結(jié)果也提示：c-myc轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增殖有關(guān)，可以作為胚胎細(xì)胞增殖的標(biāo)志物。

本研究結(jié)果表明，完全性葡萄胎絨毛合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中c-myc癌基因蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，與細(xì)胞滋養(yǎng)層和間質(zhì)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；同時(shí)與正常胎盤(pán)絨毛的c-myc蛋白表達(dá)之間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。C-myc癌基因蛋白在完全性葡萄胎組織中表達(dá)量明顯高于正常絨毛組織，提示c-myc與完全性葡萄胎的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。它還可能有利于其它促增殖癌基因的變異，并使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生存下來(lái)，促進(jìn)完全性葡萄胎的發(fā)生。

Fulop V等［7］發(fā)現(xiàn)正常胎盤(pán)、完全性葡萄胎和絨毛膜癌的合體滋養(yǎng)層染色均比部分性葡萄胎增強(qiáng)，得出結(jié)論，c-myc癌蛋白在完全性葡萄胎和絨毛膜癌的病理發(fā)生中起重要作用，而與部分性葡萄胎的發(fā)生可能無(wú)關(guān)。Yokoyama等［8］利用 Northern blot和原位雜交方法發(fā)現(xiàn)，c-myc基因在葡萄胎的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中有表達(dá)，這與我們的免疫組化染色結(jié)果相符。

Cheung A N 等［9］利用 Northern blot和免疫組化方法比較檢測(cè)了胎盤(pán)和葡萄胎中c-myc表達(dá)，發(fā)現(xiàn)c-myc在胎盤(pán)和葡萄胎組織中表達(dá)量均很低，與我們的結(jié)果不相符，可能與其所取胎盤(pán)孕齡較大及葡萄胎分型有關(guān)。李玉紅等［10］的結(jié)果表明c-myc基因表達(dá)的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤可能具有更強(qiáng)的分裂增殖活動(dòng)及浸潤(rùn)能力；郭曉梅等［11］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明c-myc基因可能參與滋養(yǎng)細(xì)胞由良性演變?yōu)閻盒缘倪^(guò)程；余志英等［12］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持c-myc基因與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)展及妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤臨床分期有關(guān)；劉金玲等［13］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明c-myc基因蛋白的過(guò)度表達(dá)與水泡狀胎塊惡變有關(guān)。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常早孕絨毛相比，cmyc基因蛋白在完全性葡萄胎組織中的表達(dá)部位和表達(dá)量均有明顯不同，結(jié)合以上分析得出結(jié)論，cmyc基因的表達(dá)與人完全性葡萄胎的發(fā)生密切相關(guān)，其激活可能是完全性葡萄胎發(fā)生的重要原因之一，還可能參與完全性葡萄胎的惡變。

圖1 正常絨毛c-myc免疫組化染色結(jié)果，示絨毛染色深淺不一，淺染絨毛中細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞著色稍深，間質(zhì)陰性表達(dá)，×100圖2 正常絨毛c-myc表達(dá)示深染絨毛，c-myc在細(xì)胞滋養(yǎng)層中的表達(dá)強(qiáng)度高于合體滋養(yǎng)層，×400圖3 正常絨毛c-myc表達(dá)示淺染絨毛中細(xì)胞滋養(yǎng)層c-myc表達(dá)強(qiáng)度高于合體滋養(yǎng)層，×400圖4 完全性葡萄胎絨毛組織c-myc免疫組化染色結(jié)果，示所有絨毛深染，×100圖5 完全性葡萄胎絨毛組織c-myc免疫組化染色結(jié)果，示細(xì)胞滋養(yǎng)層和間質(zhì)呈陰性表達(dá)；合體滋養(yǎng)層細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，×400圖6 完全性葡萄胎絨毛組織c-myc免疫組化染色結(jié)果，示細(xì)胞滋養(yǎng)層和間質(zhì)呈陰性表達(dá)；合體滋養(yǎng)層細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，蘇木素復(fù)染，×400

表1 完全性葡萄胎和正常絨毛c-myc蛋白免疫組化染色圖像分析和統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Image Analysis of C-myc Expression by immunohistochemical staining method and Statistical Result in Complete Hydatidiform Mole and Normal Villi

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Experimental Study of the Expression of C-myc Gene in Human Complete Hydatidiform Moles

Zhang Xiaoli1，Zhao Shuwu2，Wang Fuwu1，Bing Lujun1，Hao Jing1＊
（1Department of Histology and Embryology，Medical School，Shandong University，Jinan250012；2Department of Histology and Embryology，Tianjin University of Traditional Chinese Medicince，Tianjin300193，China）

Objective To study the expression and significance of the c-myc gene in human complete hydatidiform moles.Methods 30hydatidiform moles and 10normal early-pregnancy aborted samples were obtained to detect the c-myc gene expression by using SABC immunohistochemical staining，and image analysis was used to analyze the c-myc expression in complete hydatidiform moles and normal villi.Results Compared with those of the normal villi，the amount and the spatial characteristics of c-myc gene expression in hydatidiform moles are quite different.Conclusion The c-myc gene may has a close relationship with the genesis of human complete hydatidiform moles.

C-myc gene；Hydatidiform mole；Placental Villus；Immunohistochemistry

R737.33

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.011

2011-05-05

2011-09-20

張曉麗，女（1972年），漢族，講師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）