尹燕志 牟授菡 鞠建偉＊ 呂叢奎 孫曉燕 鄧?yán)谛?/p>

高糖對(duì)原代培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞表達(dá) MMP-9、TIMP-1的影響

尹燕志1牟授菡1鞠建偉1＊呂叢奎1孫曉燕1鄧?yán)谛?

（1山東煙臺(tái)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)醫(yī)院，煙臺(tái)264006；2山東先聲麥得津生物制藥有限公司，煙臺(tái)264003）

目的 了解高糖對(duì)原代培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞表達(dá) MMP-9、TIMP-1和 MMP-9／TIMP-1的影響，進(jìn)一步探討糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制。方法 取自愿水囊引產(chǎn)的胎兒腎，解剖取腎皮質(zhì)剪碎，應(yīng)用腎皮質(zhì)組織塊法合優(yōu)生選擇法對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。ELISA方法檢測(cè) MMP-9、TIMP-1的表達(dá)變化。結(jié)果 與正常組相比較，高糖組 MMP-9在24h、48h、72h均顯著降低（P＜0.01），TIMP-1在24h、72h可顯著升高 （P＜0.05），48h表達(dá)降低；MMP-9／TIMP-1的比值在24h、48h、72h均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論 高糖能夠降低 MMP-9／TIMP-1，與腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)降解能力降低密切相關(guān)。

人系膜細(xì)胞；原代培養(yǎng)；金屬基質(zhì)蛋白酶9；金屬蛋白酶組織抑制劑1；高糖

細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）增多是糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）的主要病理標(biāo)志［1］，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）、金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）是參與ECM 降解的主要酶系統(tǒng)［2］。本研究通過(guò)體外人胚腎小球系膜細(xì)胞（glomerular mesangial cells，GMCs）原代培養(yǎng)并給予高糖環(huán)境刺激，模擬糖尿?。╠iabetes mel-litus，DM）體內(nèi)病理環(huán)境，了解高糖對(duì)GMCs表達(dá)MMP-9，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitors of metalloproteinases-1，TIMP-1）的 影響，進(jìn)一步探討DN的病理生理機(jī)制。

材料和方法

1.材料

DMEM低糖培養(yǎng)基（美國(guó)ScienCell），胎牛血清（Gibco公司），MsCM（含2%FBS和 MsCGS）（美國(guó)ScienCell），膠原酶Ⅳ（Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）（Gibco公司），牛血清白蛋白（美國(guó)Amresco）小鼠抗人α-肌動(dòng)蛋白、小鼠抗人抗肌球蛋白單克隆抗體、小鼠抗人抗波形蛋白、小鼠抗人抗結(jié)蛋白、細(xì)胞角蛋白（武漢博士德）、Ⅷ因子一抗（SantaCruz公司），羊抗鼠IgG-FITC熒光二抗（武漢博士德），人 MMP-9、TIMP-1ELISA 試劑盒（武漢博士德）。

1.2 腎組織來(lái)源

取我院自愿水囊引產(chǎn)的妊娠16-32周的胎兒腎（經(jīng)胎兒家屬同意捐贈(zèng)，孕母無(wú)糖尿病、高血壓、冠心病等其它病史及傳染病病史）。

2.方法

2.1 GMCs體外培養(yǎng) 應(yīng)用腎皮質(zhì)組織塊法合優(yōu)生選擇法［3］培養(yǎng)GMCs，解剖取腎皮質(zhì)，剪碎，置200目不銹鋼篩網(wǎng)上過(guò)濾，收集篩網(wǎng)上組織，加入含0.15%Ⅳ型膠原酶的DMEM低糖培養(yǎng)基，在37℃恒溫電磁攪拌器上電磁攪拌熱消化30min離心兩次后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從第三代起更換為MsCM培養(yǎng)基。以下實(shí)驗(yàn)均選用3-7代細(xì)胞。

2.2 選取3代的GMCs在相差顯微鏡下觀察其形態(tài)。

2.3 免疫熒光化學(xué)鑒定 用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，滴加0.5%Triton X-100，10%小牛血清白蛋白封閉，滴加PBS稀釋的一抗（α-肌動(dòng)蛋白、抗肌球蛋白、波形蛋白、結(jié)蛋白、角蛋白、Ⅷ因子一抗稀釋濃度分別為1∶50、1∶50、1∶100、1∶50、1∶25、1∶20），4℃冰箱過(guò)夜，滴加IgG-FITC熒光二抗（稀釋度為1∶32，37℃避光反應(yīng)60min，50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并攝影。

2.4 ELISA方法檢測(cè) MMP-9、TIMP-1取培養(yǎng)皿中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的系膜細(xì)胞，以5×105／ml接種于96孔板上。貼壁生長(zhǎng)24h以后，更改為含0.5%FBS的MsCM培養(yǎng)24h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組的不同加入相應(yīng)的培養(yǎng)液：正常組（NG）：葡萄糖5mmol／L；高糖組（HG）：葡萄糖30mmol／L；每組設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔分別培養(yǎng)24、48、72h后收集細(xì)胞上清，-20℃下保存待測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

此時(shí)此刻，世間的萬(wàn)事萬(wàn)物都已經(jīng)失去了往日的光華，往日生機(jī)勃勃的景象已不復(fù)存在，清寒的氣息開(kāi)始遍布大地，你開(kāi)始翻撿出了厚厚的冬衣！

所有數(shù)據(jù)均以 表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.GMCs形態(tài)學(xué)觀察

培養(yǎng)7-10d后，相差顯微鏡下可見(jiàn)大量細(xì)胞呈梭形，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，部分細(xì)胞呈不規(guī)則星形和細(xì)長(zhǎng)形，單核，密集生長(zhǎng)時(shí)可重疊，其中偶見(jiàn)鵝卵石樣上皮細(xì)胞和扁平的多邊形內(nèi)皮細(xì)胞（圖1）。

2.免疫熒光化學(xué)鑒定結(jié)果

免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示，GMCs小鼠抗人α-肌動(dòng)蛋白、抗肌球蛋白單克隆抗體、抗結(jié)蛋白、抗波形蛋白表達(dá)為陽(yáng)性（圖2-5），細(xì)胞角蛋白、Ⅷ因子一抗表達(dá)為陰性，符合腎小球系膜細(xì)胞特征。

3.高 糖 下 GMCs 表 達(dá) MMP-9、TIMP-1 及MMP-9／TIMP-1的變化

與正常組相比，高糖組在24h、48h、72h表達(dá)MMP-9均顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)表1；TIMP-1在24h、72h顯著升高 （P＜0.05），48h表達(dá)降低，見(jiàn)表2；MMP-9／TIMP-1的比值在24h、48h、72h均顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表1 高糖對(duì)系膜細(xì)胞表達(dá)MMP-9的影響Table 1 Effects of high glucose on the expression of MMP-9in GMCs （pg／ml，ˉx±s，n＝6）

表2 高糖對(duì)系膜細(xì)胞表達(dá)TIMP-1的影響Table 2 Effects of high glucose on the expression of TIMP-1in GMCs （pg／ml，xˉ±s，n＝6）

表3 高糖對(duì)系膜細(xì)胞分泌MMP-9／TIMP-1的影響Table 3 The ratio of MMP-9／TIMP-1in GMCs at different time points（pg／ml，ˉx±s，n＝6）

討 論

MMP-9是人體內(nèi)最重要的MMPs之一，因其作用底物廣泛，表達(dá)細(xì)胞多，且能參與人體許多生理及病理過(guò)程而備受重視。TIMP-1是 MMP-9特異性抑制因子，在ECM積聚和降解的生理平衡中起關(guān)鍵作用?，F(xiàn)已證實(shí)，腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等均能不同程度地表達(dá)MMP-9。近年來(lái)的研究提示，高糖環(huán)境能夠引起MMPs／TIMPs的異常表達(dá)。Singh等［4］把原代培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞在30mmol／L葡萄糖環(huán)境培養(yǎng)5d，其MMP-1、MMP-2活性及表達(dá)均顯著降低，TIMP-2表達(dá)增加。Han等［5］發(fā)現(xiàn)，高糖可使大鼠腎近端小管細(xì)胞 MMP-2的表達(dá)和活性下降，TIMP-2的表達(dá)及活性上調(diào)。Qi等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境中培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞MMP-9表達(dá)增加，TIMP-1 表 達(dá) 減 少。 姚 芳 等［7］體 外 培 養(yǎng) 大 鼠HBZY-1腎小球 系膜細(xì)胞 株，采用 RT-PCR 及Western印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高糖可以通過(guò)減少M(fèi)T1-MMP表達(dá)引起腎小球ECM代謝失衡而發(fā)生積聚。本研究觀察了高糖環(huán)境下GMC表達(dá) MMP-9及TIMP-1的變化，與正常組相比較，發(fā)現(xiàn)高糖組MMP-9在 24h、48h、72h 均 顯 著 降 低，高 糖 組TIMP-1在24h、72h可顯著升高 ，48h表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MMP-9／TIMP-1的比值高糖組與正常組相比在24h、48h、72h均顯著降低，說(shuō)明 MMPs和TIMPs的比值變化是維持正?；|(zhì)成分的重要因素，隨著高糖培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MMP-9／TIMP-1的比值改變?cè)趨⑴c系膜細(xì)胞降解能力降低，細(xì)胞外基質(zhì)增加中發(fā)揮著更重要的作用，對(duì)于高糖下是通過(guò)何種途徑影響系膜細(xì)胞 MMP-9、TIMP-1表達(dá)的，有待進(jìn)一步研究。

［1］SV McLennan，DJ Kelly，M Schache，et al.Advanced glycation end products decreasemesangial cell MMP-7：A role in matrix accumulation in diabetic nephropathy？Kidney International，2007（72）：481-488

［2］Shuichi Ohtomo，Masaomi Nangaku，Yuko Izuhara，et al.The role of megsin，a serine protease in hibitor，in diabetic mesangial matrix accumulation.Kidney International，2008，74：768-774

［3］尹燕志，張李梅，鞠建偉，等.人腎小球系膜細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改進(jìn).中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（11）：1939-1942

［4］Singh R，Song RH，Alavi N，et al.High glucose decreases matrix Metallop-roteinase-2activity in rat mesangial cells via transforming growth Factor-betal.Exp Nephrol，2001，9（4）：249-257

［5］Han SY，Jee YH，Han KH，et al.An imbalance between matrix metalloproteinase-2and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2contributes to the development of early diabetic nephropathy.NephrolDial Transplant，2006，21（9）：2406-2416

［6］Qi W，Poronnik P，Young B，et al.Human cortical fibroblast responses to high glucose and hypoxia.Nephron Physiol，2004，96（4）：121-129

［7］姚 芳，閆 喆，史永紅，等.高糖刺激下大鼠腎小球系膜細(xì)胞CTGF和MT1-MMP的表達(dá).中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2009，18（1）：29-32

圖 版 說(shuō) 明

圖1 人腎小球系膜細(xì)胞原代培養(yǎng)第21天（×100）。

圖2 原代培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞α-肌動(dòng)蛋白表達(dá)陽(yáng)性（×400）。

圖3 原代培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞抗平滑肌肌球蛋白表達(dá)陽(yáng)性（×400）。

圖4 原代培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞結(jié)蛋白表達(dá)陽(yáng)性（×400）。

圖5 原代培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性（×400）。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Human glomerular mesangial cells primary cultured at day 21（×100）.

Fig.2 Primary cultured human glomerular mesangial cells showingα-smooth positive cells（×400）.

Fig.3 Primary cultured human glomerular mesangial cells showing anti-myosin positive cells（×400）.

Fig.4 Primary cultured human glomerular mesangial cells showing desmin positive cells（×400）.

Fig.5 Primary cultured human glomerular mesangial cells showing vimentin positive cells（×400）.

Effects of high glucose on the expression of MMP-9and TIMP-1 in primary cultured human mesangial cells

Yin Yanzhi1，Mu Shouhan1，Ju Jianwei1＊，Lv Congkui1，Sun Xiaoyan1，Deng Leixiu2
（1Yantai Economy Technology Development Zone Hospital，Yantai 264006；2Shandong Simcere-Medgenn Bio-pharmaceutical Company，Yantai 264003，China）

Objective To observe the effect of high glucose on the expression of MMP-9，TIMP-1and the ratio of MMP-9／TIMP-1in primary cultured human mesangial cells，and to elucidate their possible roles in diabetic nephropathy.Methods Kidneys isolated from voluntary induced of labor with water bag were cut into pieces，and human mesangial cells were cultured with the method of renal cortical tissue combined with eugenic selection.Then ELISA was used to measure the expression of MMP-9and TIMP-1.Results Compared with that of the normal group，the expression of MMP-9in the high glucose group was significantly lower at 24h，48hand 72h（P＜0.01）；TIMP-1was higher at 24hand 72hand lower at 48h（P ＜0.05）；but the ratio of MMP-9／TIMP-1was decreased constantly at 24h，48hand 72h（P＜0.01）.Conclusion High glucose decreases the ratio of MMP-9／TIMP-1in mesangial cells in vitro，which may contribute to the inhibition of ECM degradation in glomerulus.

Human mesangial cells；Primary culture；Matrixmetalloproteinase-9；Tissue inhibitor of metalloproteinases-1；High glucose

R363

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.018

2011-05-24

2011-08-26

尹燕志，男（1977年），漢族，主治醫(yī)師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）