劉坤，孫來娣，高華，伏圣青，梁惠，于茲東

（1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，山東 青島 266021；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué) 院醫(yī)學(xué)營養(yǎng)研究所，山東 青島 266021）

兒茶素是以A2苯基苯并吡喃為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的類黃酮化合物,是茶葉中主要的一類生物活性成分[1]，具有強抗氧化[2]、預(yù)防癌癥等多種功能[3]。隨著對茶兒茶素類化合物保健功能研究的不斷深入，茶葉提取物在醫(yī)藥、食品和日用化工中的使用量也與日俱增；同時，人們對茶提取物的安全性、兒茶素類的純度，尤其是主要功能性成分提出了更高的要求，因此它的開發(fā)應(yīng)用前景十分美好[4-6]。

目前提取兒茶素最常用的方法是溶劑萃取法[7-8]，該法工藝提取條件簡單易行，但由于在提取過程中兒茶素易受提取條件的變化而被氧化降解，從而導(dǎo)致產(chǎn)品顏色深，且得率大大降低。本研究首次發(fā)現(xiàn)pH對提取液中茶兒茶素的穩(wěn)定性有顯著影響，通過控制提取液的pH可使兒茶素的收率大大提高，進一步探討溶劑萃取法提取兒茶素的優(yōu)化條件，建立了溶劑萃取法提取兒茶素的新工藝。同時本實驗利用兒茶素與香草醛的羥醛縮合反應(yīng)生成紅色產(chǎn)物，用香草醛—濃鹽酸比色法[9-10]測定兒茶素的含量，這為快速、簡便的測定兒茶素提供了基礎(chǔ)，使得實驗既經(jīng)濟又便捷。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

茶葉:嶗山綠茶等（市購）；兒茶素（95%純）：杭州禾田生物股份有限公司；無水乙醇、香草醛、濃鹽酸等；723N型分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、可控恒溫水浴鍋：上海愛郎儀器有限公司；離心沉淀機：上海醫(yī)用分析儀器廠；AL104電子天平：梅特勒—托利多儀器上海有限公司；TU—1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 兒茶素提取工藝流程

取茶葉粉末10 g，按一定料液比（g/mL）加入乙醇溶劑，加酸調(diào)pH，于設(shè)定溫度下恒溫提取一定時間，離心分離后取上層清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，然后經(jīng)真空干燥得兒茶素粗提物，測定其兒茶素含量。

1.2.2 兒茶素含量測定

采用香草醛-濃鹽酸法[11]。該法的原理是：在酸催化作用下，兒茶素分子中的間苯二酚或間苯三酚與香草醛發(fā)生縮合反應(yīng)而形成有色的正碳離子。

2 結(jié)果與討論

2.1 加入抗氧化劑及調(diào)pH對兒茶素得率的影響

兒茶素在提取過程中易被氧化變色，導(dǎo)致提取率大大降低。表1為通過加入不同抗氧化劑及調(diào)pH值對兒茶素得率的影響。

表1 抗氧化劑及pH值對兒茶素得率的影響（n＝3）Table 1 Anti－oxidant and pH value on the yield of catechin（n＝3）

表1可以看出，加入抗氧劑和調(diào)pH均能不同程度的提高兒茶素的提取率，其中調(diào)pH影響最大，這是因為兒茶素在中性或堿性條件下不穩(wěn)定，易被氧化降解，而當其在pH<4的酸性條件下則相當穩(wěn)定[12]。但隨著酸度的提高其得率有所降低，這可能是由于酸度過高破壞了其分子中的基團。從表1還可以得出用鹽酸調(diào)pH比用檸檬酸調(diào)pH效果好。

2.2 純水及不同乙醇濃度對兒茶素得率的影響

由于茶葉的目標浸提物兒茶素中含有多種親水性物質(zhì)，如：糖、蛋白質(zhì)、果膠等。兒茶素類物質(zhì)浸出過程中需要與這些物質(zhì)脫離，由于乙醇濃度的不同，從而導(dǎo)致了這些物質(zhì)在乙醇中的溶解度不同[13]，如表2所示。

表2 純水及乙醇濃度對兒茶素得率的影響（n＝3）Table 2 Pure water and different ethanol concentration on the yield of catechin（n＝3）

由表2可知：一方面在高濃度的乙醇（>70%）中，親水性物質(zhì)不易溶解，因而影響浸提液對茶葉的浸潤，導(dǎo)致提取率下降；另一方面乙醇濃度過低兒茶素類物質(zhì)不能被充分地浸提出來同樣導(dǎo)致提取率下降。表2顯示的是不同乙醇濃度對提取率的影響：60%乙醇>70%乙醇>80%乙醇>50%乙醇，綜合考慮以上因素用60%的乙醇即可達到最佳提取效果。

2.3 不同溫度對兒茶素得率的影響

溫度對兒茶素提取有兩方面的作用，溫度升高，可加速傳質(zhì)過程，有利于有效成分的溶出，短時間內(nèi)即可達固液相平衡，提高兒茶素的得率；另一方面，溫度的升高也會加速兒茶素的氧化，降低其得率[14]。表3為在不同溫度下的提取效果。

表3 不同溫度對兒茶素得率的影響（n＝3）Table 3 Different temperature on the yield of catechin（n＝3）

表3可以看出，在一定范圍內(nèi)（40℃～60℃）隨著溫度的升高兒茶素得率增大，但隨后兒茶素得率隨溫度升高而有所降低。由于本實驗中通過調(diào)pH值使得兒茶素穩(wěn)定性大大提高，所以即使溫度高于70℃任然有較好得率。綜合考慮各因素溫度控制在50℃～60℃即可。

2.4 不同料液比對兒茶素得率的影響

表4為不同料液比對兒茶素得率的影響。

由表4可知，隨著料液比的增加，兒茶素的得率也隨之增加，但當料液比達到1∶17之后，其得率增加并不顯著，綜合考慮各因素，選用1∶17的料液比即可。

2.5 不同提取時間對兒茶素得率的影響

表5為不同提取時間對兒茶素得率的影響。

由表5可知在10 min～30 min內(nèi)隨著提取時間的增加，兒茶素的得率也隨之增加，隨后隨著時間的增加兒茶素得率有所降低，這是由于隨著時間的延長兒茶素逐漸被氧化，因此綜合考慮各因素提取時間為30 min為宜。

表4 不同料液比對兒茶素得率的影響（n＝3）Table 4 Different ratio of material to solvent on the yield of catechin（n＝3）

表5 不同提取時間對兒茶素得率的影響（n＝3）Table 5 Different time on the yield of catechin（n＝3）

2.6 提取條件的優(yōu)化

以提取液中兒茶素的得率為指標，對pH（A）、提取溫度（B）、乙醇濃度（C）、料液比（D）、浸提時間（E），設(shè)計L16（45）正交試驗結(jié)果見表6。

表6 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental design and results

結(jié)果表明，從茶葉中提取兒茶素的最佳提取條件為A2B2C2D2E4，即pH值為4，提取溫度為60℃，乙醇濃度為60%，料液比為1∶15（g/mL），提取時間為90 min。影響兒茶素含量的因素依次為：A＞C＞E＞D＞B，即pH＞乙醇濃度＞浸提時間＞料液比＞提取溫度。由于最優(yōu)條件下時間較長90 min，而影響不是特別顯著，所以從實際出發(fā)一般選擇30 min即可達到較好得率。而這些條件與前面單因素水平試驗幾乎達到一致，這充分證實了前面單因素試驗對提取兒茶素的可靠性。

2.7 優(yōu)化條件測定各種茶葉中兒茶素的得率

分別以嶗山舊綠、嶗山新綠、日照綠茶、福建鐵觀音、福建茉莉花茶、福建烏龍、云南普洱、安徽紅茶為材料，在上述優(yōu)化條件下分別提取兒茶素，結(jié)果見表7。

表7 優(yōu)化條件測定各種茶葉中兒茶素的得率（n＝3）Table 7 Determining catechin yield of various tea under the optima conditions（n＝3）

表7可以看出，不同產(chǎn)地的綠茶其得率有所不同，即使是同一產(chǎn)地的綠茶，去年采收和今年采收其得率任然有所差距，這可能與采收季節(jié)、采收時間及其其它因素有關(guān)。表7中云南普洱和安徽紅茶中兒茶素得率極低，福建鐵觀音兒茶素得率稍偏低，這是由于云南普洱和安徽紅茶是全發(fā)酵茶，福建鐵觀音是半發(fā)酵茶，其中的兒茶素不同程度地被氧化降解，從而導(dǎo)致兒茶素得率大大降低或部分降低。

3 結(jié)論

利用乙醇溶液可以有效的提取茶葉中兒茶素成分，影響實驗的主要因素依次為pH、乙醇濃度、浸提時間、料液比、提取溫度；結(jié)合正交試驗結(jié)果以及從各方面考慮得到優(yōu)化條件為：pH值為4，提取溫度為60℃，乙醇濃度為60%，料液比為1∶15（g/mL），提取時間為30 min。同時采取香草醛—濃鹽酸法測定茶葉中總兒茶素既經(jīng)濟又方便，適合于探索性實驗的大批量快速進行。

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