齊香君，徐婷婷，張?chǎng)降窃?/p>

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安，710021)

一株油脂降解菌的性能研究

齊香君，徐婷婷，張?chǎng)?，冉登?/p>

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安，710021)

為 尋找高效的油脂降解菌，從餐廳油煙排出口附近篩選出一株油脂降解菌QZX-A，并采用形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定、基因測(cè)序等方法對(duì)其進(jìn)行分類鑒定;采用比濁法和稱重法對(duì)該菌株的生長(zhǎng)性能進(jìn)行研究;采用排油圈法及蒽酮硫酸法研究了QZX-A菌株生產(chǎn)鼠李糖脂的性能。結(jié)果:形態(tài)學(xué)指標(biāo)、生理生化指標(biāo)均顯示QZX-A菌株具備銅綠假單孢桿菌的特征，基因測(cè)序結(jié)果表明QZX-A菌株基因序列與銅綠假單孢桿菌序列的相似度達(dá)98%;QZX-A菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中具有相似的生長(zhǎng)曲線，但前者的生長(zhǎng)速率大于后者;QZX-A菌株代謝產(chǎn)物屬于糖脂類化合物，其排油圈可達(dá)11 cm，產(chǎn)量為567.75 mg/L。QZX-A菌株遺傳性狀穩(wěn)定。

油 脂降解，銅綠假單胞菌，鼠李糖脂

隨著餐飲業(yè)蓬勃發(fā)展，餐飲廢水日益增多。這些油脂廢水如不經(jīng)處理排放后會(huì)飄浮于水體表面，影響水體的復(fù)氧及其自然凈化過程，危害水體生態(tài)系統(tǒng)并且對(duì)周圍環(huán)境造成嚴(yán)重污染［1］。因此，找到一種簡(jiǎn)便、快速、高效的方法來(lái)處理餐飲廢水中的油脂，以解決這一刻不容緩的環(huán)境問題。本研究根據(jù)Bergey系統(tǒng)和常見細(xì)菌鑒定方法結(jié)合基因測(cè)序等方法對(duì)從教職工餐廳油煙排污口分離出的能利用菜籽油的細(xì)菌QZX-A進(jìn)行分類鑒定研究;利用比濁法和重量法對(duì)該菌株的生長(zhǎng)性能進(jìn)行研究;應(yīng)用蒽酮硫酸法及排油圈法，研究了QZX-A菌株代謝鼠李糖脂的生產(chǎn)性能。通過測(cè)定多次傳代后QZX-A菌株的形態(tài)和鼠李糖脂的生產(chǎn)能力研究了該菌株的遺傳性能。這為該菌株的開發(fā)應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 試藥與儀器

1.1 QZX-A菌株來(lái)源

教職工餐廳油煙排出口分離篩選得到。

1.2 培養(yǎng)基配制

(1)分離培養(yǎng)基:KH2PO40.05%，K2HPO40.1%，(NH4)2SO40.1%，MgSO4·7H2O 0.01%，NaCl 0.5%，菜籽油3 mL/L，混合乳化劑(司盤-80∶吐溫-80=1∶1.14)5 mL/L，瓊脂 2%，pH 7.5;(2)發(fā)酵培養(yǎng)基:KH2PO40.05%，K2HPO40.05%，(NH4)2SO40.1%，MgSO4·7H2O 0.01% ，菜籽油2%，pH8;(3)保藏培養(yǎng)基:牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH7.5

1.3 顯色劑配制

(1)茚三酮顯色劑:0.5 g茚三酮溶于100 mL的無(wú)水丙酮中;(2)蒽酮顯色劑:1 g蒽酮和5 mL硫酸溶于95 mL的乙醇中。

1.4 主要儀器設(shè)備

DPX-9082B-1培養(yǎng)箱，HYG-Ⅱa回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜，752型紫外分光光度計(jì)

2 試驗(yàn)方法

2.1 蒽酮硫酸法

取適當(dāng)稀釋倍數(shù)的發(fā)酵液1.0 mL置試管中，于冰水浴中加入0.2%的硫酸-蒽酮試劑4 mL，加完后混合均勻浸于沸水浴中，15 min后取出，用自來(lái)水冷卻，室溫放置20 min?？瞻讓?duì)照以未接種的培養(yǎng)基代替發(fā)酵液，620 nm處進(jìn)行紫外檢測(cè)［2］。

2.2 排油圈法

取一直徑20cm培養(yǎng)皿，加入200 mL蒸餾水，水面中央加250μL液體石蠟形成油膜。在油膜中心加250μL發(fā)酵液，中心油膜被擠向四周形成排油圈，記錄排油圈的直徑［3］。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)研究

采用菌落觀察、染色及顯微觀察的方法，對(duì)菌落大小、性狀、光澤、顏色、硬度、透明度，菌體顯微形態(tài)(100×)，革蘭氏染色，以及是否運(yùn)動(dòng)，是否產(chǎn)色素等方面對(duì)菌體進(jìn)行詳細(xì)描述，根據(jù)Bergey系統(tǒng)進(jìn)行分類［4］。

2.3.2 生理生化鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［4］，對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行接觸酶實(shí)驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、甲基紅(M.R)實(shí)驗(yàn)、V-P測(cè)定、吲哚實(shí)驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)。

2.3.3 16srDNA序列測(cè)定

①將QZX-A菌株純培養(yǎng)物于12 000 r/min離心3 min，收集菌體加入2.7 mL DNA抽提Buffer，充分懸浮，加入20 μL 10 mg/mL的蛋白酶K，37℃振蕩30 min。②加入0.3 mL 20%SDS，混勻后于65℃恒溫靜置2 h，期間每20 min上下顛倒幾次，12 000 r/min離心10 min。③將上清液轉(zhuǎn)至離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1，V/V)抽提 10 min，于 12 000 r/min離心10 min。重復(fù)該步驟1次。④將上清轉(zhuǎn)至離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫靜置1 h后于14 000 r/min離心10 min收集粗DNA。⑤沉淀的粗DNA用70%冰乙醇輕輕刷洗，棄刷洗液后晾干。⑥加入無(wú)菌超純水溶解DNA后用核酸/蛋白分析儀于Nucleic Acid程序下測(cè)定其濃度。⑦PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:94℃5 min;94℃30 min，56℃30 min，72℃2 min，30個(gè)循環(huán);72℃，10 min。⑧取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL電泳，于UVI凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。⑨將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Blast軟件進(jìn)行同源性比較［3］。

2.4 不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)特性

分別繪制QZX-A菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線:采用比濁法和稱重法［5］。

2.5 QZX-A菌株生產(chǎn)鼠李糖脂性能研究

2.5.1 代謝產(chǎn)物的定性

取30℃，130 r/min培養(yǎng)3 d的發(fā)酵液及表面活性劑粗品進(jìn)行TLC層析，以V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=70∶10∶0.5為展開劑，用不同的顯色劑顯色:(1)茚三酮顯色劑，脂肽顯紅色;(2)蒽酮顯色劑，糖脂顯黃色斑點(diǎn)。

2.5.2 排油性能

取30℃，130 r/min培養(yǎng)3 d的發(fā)酵液，適當(dāng)稀釋后，采用排油圈法，記錄排油圈直徑，初步判斷產(chǎn)物中是否含表面活性劑及含量多少。

2.5.3 產(chǎn)鼠李糖脂性能

取30℃，130 r/min培養(yǎng)3 d的發(fā)酵液，適當(dāng)稀釋后，采用蒽酮硫酸法測(cè)定發(fā)酵液中鼠李糖的量。鼠李糖脂產(chǎn)量=×3×n(n=發(fā)酵液稀釋倍數(shù))。

2.6 遺傳穩(wěn)定性考察

采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基連續(xù)傳代的方法，通過對(duì)每代菌種進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;通過發(fā)酵培養(yǎng)基液體培養(yǎng)測(cè)定其代謝產(chǎn)物鼠李糖脂的含量，研究QZXA菌株的遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié)果與討論

3.1 QZX-A菌株的鑒定

3.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌落呈圓形，邊緣整齊，直徑2mm左右，表面濕潤(rùn)，薄，中間略突起，在含油平板上有較明顯的透明圈，如圖1(A)。顯微鏡下(100×)QZX-A菌株為短桿狀細(xì)菌，末端鈍圓，革蘭氏陰性，無(wú)芽孢，不運(yùn)動(dòng)，如圖1(B)。產(chǎn)綠色素，平板培養(yǎng)后期綠色素浸透整個(gè)平板，在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中呈均勻混濁狀態(tài)，綠色素分布在液面附近，如圖1(C)所示。

圖1 QZX-A形態(tài)學(xué)鑒定

3.1.2 生理生化鑒定

對(duì)QZX-A菌株進(jìn)行糖發(fā)酵、過氧化氫酶等生理生化試驗(yàn)。該菌株的生理生化特征見表1。

表1 QZX－A菌株的生理生化特征

3.1.3 基因測(cè)序鑒定

將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已報(bào)道的基因序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)QZX-A與銅綠假單胞菌的同源性達(dá)到98%，與其同源性最接近的菌種為Pseudomonas aeruginosa(AY825034)。

綜上分析表明，QZX-A的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果、生理生化指標(biāo)與假單孢菌屬的特性完全吻合，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)QZX-A與銅綠假單胞菌的同源性達(dá)到98%，。因此確定QZXA為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。上傳其基因序列至 NCBI Genbank，得到該菌株序列號(hào)HQ221563。

3.2 QZX-A菌株在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)特性

為掌握該菌株的生長(zhǎng)特性，測(cè)定了該菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖2，可以看出，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中菌體12 h已進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體在30 h才進(jìn)入穩(wěn)定期。在發(fā)酵培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)期比牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中QZX-A的對(duì)數(shù)期延長(zhǎng)18 h。其原因可能是微生物對(duì)油脂的利用速度較慢。

圖2 不同培養(yǎng)條件下QZX-A的生長(zhǎng)性能

3.3 代謝產(chǎn)物生產(chǎn)性能研究

3.3.1 代謝產(chǎn)物的定性

為判斷代謝產(chǎn)物類別，利用TLC法對(duì)其進(jìn)行鑒別。對(duì)分離的斑點(diǎn)經(jīng)蒽酮顯色劑顯色后，鼠李糖脂粗提物與發(fā)酵液都顯黃綠色斑點(diǎn)，鼠李糖脂粗提物斑點(diǎn)略大于發(fā)酵液斑點(diǎn)，判斷此種表面活性劑為糖脂類化合物，Rf=0.567。文獻(xiàn)表明銅綠假單孢桿菌有產(chǎn)鼠李糖脂的性能，因此可推斷代謝產(chǎn)物中含有鼠李糖脂。

3.3.2 排油圈的測(cè)定

為初步測(cè)試研究菌株代謝鼠李糖脂的能力，取不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液測(cè)其排油圈直徑，結(jié)果見圖3。由圖可知，排油圈的直徑隨著發(fā)酵時(shí)間的遞增而增大，60h后增加趨勢(shì)逐漸減緩，120 h發(fā)酵液的排油圈直徑達(dá)11.2 cm。

3.3.3 鼠李糖脂的定量測(cè)定

為了準(zhǔn)確了解QZX-A菌株產(chǎn)鼠李糖脂的能力，對(duì)30℃，130 r/min培養(yǎng)不同時(shí)間的QZX-A菌株發(fā)酵液采用蒽酮硫酸法測(cè)定其鼠李糖脂的量，結(jié)果見圖3，鼠李糖脂產(chǎn)量在60 h前快速增長(zhǎng)，60 h后趨于平緩，略有升高，120 h時(shí)鼠李糖脂的產(chǎn)量達(dá)1 286 mg/L。曲線趨勢(shì)平緩表明60 h后菌株產(chǎn)鼠李糖脂的能力基本達(dá)到最大，為后期發(fā)酵條件的考察打下基礎(chǔ)。

圖3將不同發(fā)酵時(shí)間的排油圈直徑變化與鼠李糖脂產(chǎn)量變化做了比較，發(fā)現(xiàn)兩者的變化趨勢(shì)一致，60 h前呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，60 h后呈較平穩(wěn)趨勢(shì)。由此推斷，發(fā)酵液的排油圈直徑與鼠李糖脂含量成正比關(guān)系。由于排油圈的測(cè)量較簡(jiǎn)便快捷，可采用排油圈法代替蒽酮硫酸法初步判斷菌種產(chǎn)鼠李糖脂的能力。

3.4 遺傳穩(wěn)定性考察

為了解實(shí)驗(yàn)菌株的遺傳穩(wěn)定性，在固體斜面連續(xù)傳代10次，對(duì)每代的QZX-A菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、定量測(cè)定發(fā)酵液鼠李糖脂含量，結(jié)果表明QZX-A產(chǎn)鼠李糖脂的性狀穩(wěn)定，轉(zhuǎn)接10代的平均產(chǎn)量為1 057.75 mg/L。

經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，QZX-A菌株多次傳代后在外觀形態(tài)，色素產(chǎn)生方面都與原始菌株保持一致，表明QZX-A菌株的具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖3 QZX-A產(chǎn)鼠李糖脂性能

4 結(jié)論

(1)本研究所用菌株QZX-A，為假單孢菌屬的銅綠假單孢菌。

(2)QZX-A菌株在降解油脂的過程中能夠產(chǎn)生表面活性劑，初步鑒定為鼠李糖脂。

(3)120h內(nèi)QZX-A菌株發(fā)酵液的排油圈直徑與發(fā)酵液中鼠李糖脂含量成正比關(guān)系。60 h后鼠李糖脂產(chǎn)量的增加趨于平緩，120h時(shí)鼠李糖脂的產(chǎn)量最大，達(dá)到1 286 mg/L。

(4)QZX-A菌株在10代內(nèi)，其外觀形態(tài)、產(chǎn)色素性能、產(chǎn)鼠李糖脂能力等遺傳性狀穩(wěn)定。

［1］ 袁惠民.含油廢水的處理方法［J］.化工環(huán)保，1998，18:146.

［2］ 盧滿國(guó)，劉紅玉，曾光明，等.鼠李糖脂快速定量分析及其影響因素研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(4):106－111.

［3］ 賈燕，尹華，彭輝，等.一株表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及其特性研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2007，34(6):1 066－1 070.

［4］ 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001.

［5］ 周德慶.微生物學(xué)教程［M］.北京:高等教育出版社，2002.

Research on the Property of an Oil-degrading Bacteria

Qi Xiang-jun，Xu Ting-ting，Zhang Wen，Ran Deng-yuan
(Colloge of Life Science and Engineering in Shaanxi university of Science and Technology，Xi＇an 710021，China)

In order to select a high-efficient oil-degrading bacteria，here an oil-degrading bacteria was selected from the lampblack exit of the restaurant，which was named QZX-A.Then，it was identified using the methods such as morphological，physiological and biochemical identification and 16S rRNA.At the same time，its growth performance was anaylzed by the turbidimetric and weighing methods.Furthmore，its ability to produce rhamnolipid was discussed by the method oil-spreading and anthrone-sulfuric acid.Results:On the basis of morphological，physiological and biochemical evidence，strain QZX-A had the characteristics of Pseudomonas aeruginosa bacteria.Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences revealed that QZX-A belonged to a phyletic sub-lineage within the family Pseudomonas，with≥98%16S rRNA gene sequence similarity to the described species.In addition，strain QZX-A had a similar growth curve in beef extract peptone and fermentation medium，but the growth rate of the former was bigger than the latter.The result of TLC showed that the metabolic products of strain QZX-A belonged to glycolipid compounds.The oil-spreading round was up to 11cm，and its productivity was 567.75 mg/L.In sum，since strain QZXA was genetically stable，it had some value of development in the degradation of oil and in the production of rhamnolipid.

oil-degradation，Pseudomonas aeruginosa，rhamnolipid

碩士，教授。

2010－09－06，改回日期:2010－10－14