米迎波黃 蔚劉 國唐序文

（1.懷化市質(zhì)量技術監(jiān)督局產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，湖南 懷化 418000；2.懷化市中方縣質(zhì)量技術監(jiān)督局質(zhì)量檢驗及計量檢定所，湖南 懷化 418005）

高效液相色譜法同時測定糕點中4種食用合成色素

米迎波1黃 蔚2劉 國1唐序文1

（1.懷化市質(zhì)量技術監(jiān)督局產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，湖南 懷化 418000；2.懷化市中方縣質(zhì)量技術監(jiān)督局質(zhì)量檢驗及計量檢定所，湖南 懷化 418005）

建立高效液相色譜法檢測糕點中4種食用合成色素的新方法。用乙醇－氨水－水（體積比為7∶2∶1）混合溶液提取樣品中的食用合成色素，聚酰胺層析柱進行凈化。色譜柱：Inertsil ODS－SP C18（150mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈－乙酸銨溶液 （0.02mol/L），梯度洗脫，檢測波長254nm。加標回收率為91%～103%。結果準確可靠，方法易于推廣。

高效液相色譜；糕點；食用合成色素

食品色素是以調(diào)節(jié)食品色澤為目的的食品添加劑，又稱食用染料或著色劑，分為天然色素和合成色素兩大類，其中，合成色素因色澤鮮艷、著色力強、穩(wěn)定性好、價格低廉等特點而被廣泛使用。最常用的合成色素有檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃和亮藍5種，其中，檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃均為偶氮類色素，有一定毒性，長期低劑量攝入，存在致畸、致癌性［1，2］；亮藍為非偶氮類酸性染料，主要有3個同分異構體，一般為3個同分異構體的混合物（間位物∶對位物∶鄰位物＝75～85∶15～20∶0～8）［3］。這5種合成色素通常被混合使用，檢測方法上，目前大多數(shù)是5種色素同時檢測［4－7］。中國允許使用的合成色素的種類正在逐漸減少，并對其使用范圍和使用量做了嚴格的規(guī)定［8］。

為了加強食品質(zhì)量安全監(jiān)督管理，中國制定了食品中合成色素測定的標準方法 GB/T 5009.35——2003［9］，但未覆蓋糕點類樣品的預處理方法。該標準中規(guī)定的第一法是高效液相色譜法，流動相為甲醇－乙酸胺（0.02M），用梯度洗脫，對包括亮藍在內(nèi)的8個色素同時進行測定，甲醇含量在12min之內(nèi)從20%增加到98%，變化跨度大，基線漂移大。亮藍主要是3種同分異構體的混合物，有3個液相色譜峰，條件不同，出峰時間不同，與其他多種色素同時測定，存在干擾。本試驗擬利用聚酰胺層析柱凈化、反相高效液相色譜法分離，建立糕點中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅和日落黃4種合成色素的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

蛋糕、老婆餅、米花糖、綠豆餅：湖南省懷化市產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所提供；

無機濾膜：0.45μm，上海密粒膜分離技術有限公司；

玻璃層析柱（2cm×30cm，配有燒結玻璃墊和聚四氟乙烯旋塞）：島津國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.1.2 試劑

檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅和日落黃標準物：0.5mg/mL，GBW（E），國家標準物質(zhì)研究中心；

乙腈、甲醇：色譜純，天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；

聚酰胺粉：粒徑0.075～0.15mm，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠；

其他所用試劑：除另有規(guī)定外，均為分析純試劑；

試驗用水：超純水。

1.1.3 儀器

高效液相色譜儀（內(nèi)附二級管陣列檢測器）：LC－20A，島津國際貿(mào)易（上海）有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ3200DA，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；

高速離心機：TC16－Ⅱ，長沙平凡儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS－SP C18（150mm×4.6mm，5μm）；柱溫25℃；流動相：A為乙腈，B為乙酸銨溶液 （0.02mol/L）；梯度洗脫（乙腈：0～5min，5%～15%；5～10min，15%～15%；10.01～18min，5%～5%）；流速1.0mL/min；進樣量10μL；檢測波長254nm。

1.2.2 標準曲線制作 將4種色素標準物用超純水配成0.01，0.02，0.03，0.04，0.05mg/mL的混合標準使用液，在設定的色譜條件下，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線。

1.2.3 聚酰胺樹脂預處理 取聚酰胺以90%～95%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后裝入柱中。用3～4倍體積的90%～95% 乙醇洗脫，洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘渣（或極少殘渣）。再依次用2～3倍體積5%的NaOH、3～4倍體積的蒸餾水、2～3倍體積的10%乙酸洗脫，最后用蒸餾水洗脫至中性，105℃條件下干燥，備用。

1.2.4 聚酰胺粉層析柱裝配 將洗凈的層析柱固定，關閉活塞。稱取經(jīng)預處理過的聚酰胺粉2～3g（稱準至0.01g）于100mL的小燒杯中，加適量的水，用玻璃棒攪拌片刻，然后邊攪拌邊裝入層析柱中，用水洗下柱內(nèi)壁的樹脂，最后用吸耳球輕敲層析柱，使樹脂層高度為3cm左右，并且較為緊密，打開旋塞，使水流出到樹脂頂部約0.5～1cm，關閉旋塞。層析柱出口與抽濾瓶導管（1 000mL，配單孔橡膠塞，孔中插有玻璃導管）、抽濾瓶與真空泵均用硅膠管連接，形成完整的抽濾系統(tǒng)。

1.2.5 樣品處理 準確稱取已粉碎均勻的糕點樣品5g（精確到0.000 1g）于50mL比色管中，加入40mL乙醇－氨水－水混合溶液（體積比為7∶2∶1），混勻并且超聲20min，室溫靜置10min，定容至刻度，搖勻，離心（6 000r/min以上），濾紙過濾，準確取20mL濾液于100mL小燒杯，用50%檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至4～5，移入層析柱，用水洗燒杯2～3次，洗液移入層析柱；打開層析柱旋塞，啟動真空泵，使色素很快吸附到樹脂上成一色素環(huán)帶，用pH 4～5的水及甲醇－甲酸混和液（6＋4）洗滌2～3次，除去天然色素，再用水洗滌2～3次，關閉真空泵，棄去洗滌液；在抽濾瓶中放1支25mL的比色管，用來接收解吸液；連接并啟動真空泵，用乙醇－氨水溶液解吸樹脂上的色素，解吸3次，每次5～6mL；關閉真空泵，倒出解吸液于50mL蒸發(fā)瓶，揮發(fā)至干，加水2mL，把殘渣充分溶解，用濾膜過濾，濾液供分析用。

2 結果與討論

2.1 樣品處理條件的選擇

（1）準確稱取粉碎的試樣5g（準確至0.000 1g）于50mL比色管中，加40mL水，超聲20min，室溫靜置10min，定容、混勻、離心和過濾，取20mL濾液，用50%檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至4～5，其余步驟按1.2.5操作，同時進行加標回收，結果見表1。

（2）準確稱取粉碎的試樣5g（準確至0.000 1g）于50mL比色管中，加40mL水，超聲20min，室溫靜置10min，加沉淀劑乙酸鋅（220g/L）、亞鐵氰化鉀 （106g/L）各2mL，其余步驟按1.2.5操作，同時進行加標回收，結果見表1。

（3）按1.2.5方法進行樣品處理，獲取試樣溶液，上機分析，同時進行加標回收，結果見表1。

表1 不同樣品處理方法的測定結果Table 1 The determination result by different processing method

由表1可知，用方法2.1（1）和2.1（2）進行樣品處理，結果不符合要求，糕點水溶液中，色素一定程度被淀粉和沉淀劑凝聚物吸附，因此，水不能作為糕點中4種色素的最佳提取液；用方法1.2.5處理樣品，4種色素的回收率高，說明乙醇－氨水－水混合溶液 （體積比為7∶2∶1）是最佳提取液。另外，按GB/T 5009.35——2003標準操作，用 G3垂融漏斗抽濾凈化和洗脫目標色素，易產(chǎn)生堵塞現(xiàn)象；而用聚酰胺層析柱進行凈化，在層析柱內(nèi)有環(huán)形色帶形成，解吸時，環(huán)形色帶向下移動，現(xiàn)象明顯，操作方便。

2.2 流動相的選擇

由于4種色素雖然均為偶氮類色素，但結構不同，等度條件下分離效果不理想。GB/T 5009.35——2003中的梯度洗脫條件跨度最大為78%甲醇，基線噪聲大。本試驗研究了乙腈－0.02M乙酸銨溶液的3個梯度洗脫條件，分離0.05mg/mL的混合標樣，3個梯度洗脫條件分別是① （乙腈：0～10min，10%～30%；10～15min，30% ～10%；15.01～20min，10%～10%）、② （乙腈：0～5min，15%～35%；5～10min，35%～35%；10.01～20min，15%～15%）和③ （乙腈：0～5min，5%～15%；5～10min，15%～15%；10.01～18min，5%～5%），結果見表2。條件①下只有3個峰，日落黃不出峰；在條件②和③下，4種色素能很好地分離，但條件③下的靈敏度最高，噪聲和基線漂移最小。從試驗結果看，梯度跨度越小，噪聲和基線漂移越小，反之亦然。因此選擇條件③為方法條件。4種色素的標準色譜圖見圖1。同時在該條件下進行樣品測定，根據(jù)二極管陣列光譜掃描圖進行目標峰定性，樣品色譜圖見圖2。

表2 同一標樣不同梯度洗脫條件的測定結果Table 2 The determination result under different gradient condition for the same standard

圖1 4種色素標準色譜圖Figure 1 Chromatogram of 4Synthetic Pigment standard

圖2 樣品色譜圖Figure 2 Chromatogram of Sample

2.3 標準曲線和方法檢出限

各標準物質(zhì)曲線回歸方程、相關系數(shù)及方法檢出限見表3。由表3可知，各標準物質(zhì)濃度在0.01～0.05mg/mL時，濃度和峰面積有良好的線性關系，相關系數(shù)均大于0.999，同時做空白試驗，檢出限以噪音的3倍計算。結果說明方法靈敏。

表3 4種色素的標準曲線回歸方程、相關系數(shù)及檢出限Table 3 That of curvilinear equation，correlation coefficient and detection limit for 4Pigment

2.4 加標回收率和精密度試驗

向不含色素本底值的試樣中加一定量的混合標樣，按1.2.5方法進行測定，考察方法的回收率，以0.05mg/mL添加水平的試樣重復測定7次，考察方法的精密度，結果見表4。結果說明方法準確可靠。

表4 加標回收率和精密度試驗結果Table 4 The test result of recovery and precision

3 結論

（1）本試驗對GB/T 5009.35——2003《食品中合成著色劑的測定》進行了優(yōu)化改進，建立了高效液相色譜檢測糕點中食用合成色素的新方法。通過試驗比較，發(fā)現(xiàn)乙醇－氨水－水混合溶液 （體積比為7∶2∶1）是糕點中食用色素的最佳提取液，水很難完全提取其中的食用色素，不能作為提取液；聚酰胺層析柱是色素提取液的最佳凈化工具，現(xiàn)象直觀明了，優(yōu)于用G3垂融漏斗凈化；用乙腈－0.02M乙酸銨溶液梯度洗脫條件對4種色素的分離效果好，基線漂移小，而按中國國標方法用甲醇－0.02M乙酸銨溶液梯度洗脫條件進行多種色素分離，分離效果差，基線漂移大；本方法加標回收率為91%～103%，相對標準偏差均小于5%，符合標準檢測方法要求。

（2）本試驗建立的新方法簡單可靠、準確可行，結果令人滿意。

（3）亮藍為3種同分異構體混合物，不適合與以上4種色素同時檢測。食品中亮藍的測定有待下一步研究。

1 陳國慶，吳亞敏，王俊，等.常用合成食品色素熒光光譜研究［J］.光譜學與光譜分析，2009，29（9）：2 518～2 522.

2 劉成倫，李小慶，王晶，等.偶氮類非食用色素的快速測定方法研究進展［J］.食品科學，2009，30（5）：273～276.

3 丁秋龍，王麗斌，陳建新.食用亮藍色素之同分異構體研究［C］//中國化工學會.第九屆全國染料與染色學術研討會暨信息發(fā)布會論文集，2004：76～78.

4 陳艷，劉思潔，李皓.高效液相色譜法測定果凍中的合成色素［J］.食品科學，2007，28（9）：487～490.

5 倪蓉，楊龍彪，張燕.高效液相色譜法同時測定果味飲料中8種添加劑［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006，16（10）：1 196～1 197.

6 陳夏芳，胡浩軍，李韜.高效液相色譜法測定肉制品中人工合成色素的研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，19（2）：313～314.

7 邢曉慧，尹未華，韓春菊，等.高效液相色譜法測定蜜餞中食用合成色素［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28（10）：133～135.

8 中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標準化管理委員會.GB 2760——2007食品添加劑使用衛(wèi)生標準［S］.北京：中國標準出版社，2008.

9 中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.35——2003食品中合成著色劑的測定［S］.北京：中國標準出版社，2004.

Determination of 4 synthetic pigment in cake product by high performance liquid chromatography

MI Ying－bo1HUANG Wei2LIU Guo1TANG Xu－wen1

（1.Department of Product or Commodity Quality Testing and Supervising，Huaihua Bureau of Quality and Technical Supervision，Huaihua，Hunan418000，China；2.Department of Quality Inspection and Measurement Calibration，Zhongfang County Bureau of Quality and Technical Supervision，Huaihua，Hunan418005，China）

A new analytical method was developed for determination for 4synthetic pigment in cake product by high performance liquid chromatography（HPLC）.The synthetic pigment in cake product in samples was extracted by ethanol－ammonia water－water（volume ratio 7∶2∶1），and it was purified by polyamide chromatography column.The HPLC conditions：Inertsil ODS－SP C18（150mm×4.6mm，5μm），acetonitrile－0.02mol/L ammonium acetate solution as mobile phase，gradient elution and UV detection at 254nm.The average recoveries were 91%to 103%.The result is accurate and easy to spread.

HPLC；cake product；synthetic pigment

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.04.021

米迎波（1970－），男，懷化市質(zhì)量技術監(jiān)督局工程師。E－mail：myb70＠126.com

2011－04－15