周永剛,張冬梅,魯 琳,羅玉蘭,卞黎霞

崇明水仙為石蒜科 (Am aryllidaceae)水仙屬(NarcissusL.)多年生草本植物,屬于中國水仙的 1個栽培類型,與漳州水仙和普陀水仙統稱為中國水仙(N.tazettaL.var.chinensisRoem.),在上海市崇明縣已有 400年以上的栽培歷史。崇明水仙具有花香幽雅、水養(yǎng)期和花期長等特點,其重瓣花型以濃郁芳香著稱于國內外花卉市場,可與英國玫瑰齊名。目前,崇明水仙的栽培品種很少,且品種混雜,加之品種資質退化、品質下降及病毒病發(fā)生等因素的影響,已處于幾近滅絕邊緣。2007年,上海市將崇明水仙列入專項拯救計劃。然而,目前還沒有關于崇明水仙遺傳背景的系統研究和報道。

對水仙細胞學特征進行分析是明確其種及品種間差別的基礎。栗田正秀[1]、Kam ae[2]和陳曉靜[3]先后進行了關于中國水仙核型的研究,均認為中國水仙是同源三倍體 (2n=3x=30)；然而,王瑞等[4]以漳州單瓣花水仙為材料得出的研究結果則有所不同,確定漳州單瓣花水仙的體細胞染色體呈三倍體趨勢,但其核型卻顯示出異源三倍體的傾向。在水仙的細胞學研究方面,李懋學等[5]于 1980年對漳州、舟山和崇明3個產地的水仙進行了染色體組型和 Giem sa C-帶帶型的比較研究,但并沒有發(fā)現品種間的明確差異。目前,有關崇明水仙不同類型的核型還未見系統的研究報道。

作者對崇明水仙細胞學研究的前處理溶液 (對二氯苯飽和溶液和 0.002mo l·L-18-羥基喹啉水溶液)及前處理時間 (8、10、12和 14 h)進行了篩選,并在細胞學水平上對重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細胞的染色體數、核型及倍性等進行了比較分析,以期為崇明水仙優(yōu)質種源的確定、莖和花型的改良、花期的調控、切實可行的栽培保種措施的制定及其推廣和應用奠定研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的重瓣花型和單瓣花型崇明水仙鱗球均來源于上海市崇明縣百葉水仙花專業(yè)合作社二基地。

1.2 方法

1.2.1 前處理液及前處理時間的篩選 選取健康、直徑 8 cm的 3年生水仙商品球鱗球,每種花型 10個,經低溫處理解除休眠后,剝去外層褐色的干皮膜,洗凈后置于培養(yǎng)皿中水培,每天換水 1～2次；經 3～5 d培養(yǎng),待根尖長至 0.5～1.0 cm時,在上午 9：00至 10：00時采集根尖備用。

分別用對二氯苯飽和溶液和 0.002 mo l·L-18-羥基喹啉水溶液對根尖進行前處理,浸泡時間設置 4個梯度(8、10、12和 14 h),每個時間梯度重復3次。將經過前處理的根尖用蒸餾水清洗后置于卡諾固定液〔V(無水乙醇)∶V(冰乙酸)=3∶1〕中固定 24 h；再轉入 1mo l·L-1HC l溶液中于 60℃恒溫條件下解離 7m in,水洗后用改良石炭酸品紅染色并壓片；采用冰凍法揭片,待干燥后用中性樹膠封片[6]。使用LeicaDM 2000-4N30系統生物顯微鏡(德國萊卡公司生產)觀察各處理的細胞分裂情況并計算分裂指數,從而篩選出適宜的前處理液和前處理時間。

1.2.2 根尖染色體壓片及觀察 根據上述預實驗結果,對根尖進行前處理并按照上述實驗操作流程進行制片和觀察。使用Leica DM 2000-4N 30系統生物顯微鏡進行觀察,每種花型各選擇 50個染色體清晰、分散良好的中期分裂相進行觀察、計數和拍照。采用Adobe Photoshop CS 8.0.1圖像處理軟件編輯后,各選取 10張照片按李懋學等[7]的方法進行染色體核型分析。

1.3 數據處理及計算

分裂指數 =(中期細胞數/觀察細胞總數)× 100％。染色體相對長度系數（index of relative length,I.R.L)組成按照 Kuo等的方法[8]進行分析,染色體相對長度計算公式為：I.R.L=(染色體長度/全組染色體總長度)×100％；臂比計算公式為：臂比=長臂長度 /短臂長度；按照 Stebbins的標準[9]進行核型分類；核型不對稱系數 (asymm etrical karyotype coefficient,A s.k)按照 A rano的方法[10]計算,計算公式為：A s.k=(長臂總長/全組染色體總長)×100％。

2 結果和分析

2.1 適宜的前處理液和前處理時間

為提高崇明水仙根尖體細胞中期細胞的分裂指數,采用對二氯苯飽和溶液和 0.002mo l·L-18-羥基喹啉溶液這 2種常用于植物染色體的前處理液對根尖進行預處理,并分別設置了 8、10、12和 14 h的前處理時間。結果表明 (表 1)：采用不同的前處理液進行前處理,崇明水仙根尖所需的前處理時間不同；對二氯苯飽和溶液的前處理效果優(yōu)于 0.002 mol· L-18-羥基喹啉溶液,染色體處于分裂中期的細胞數較多,分裂指數最高可達 7.21％,且染色體容易分散、結構比較清晰。因此,適宜于崇明水仙細胞學實驗的前處理液為對二氯苯飽和溶液,最佳前處理時間為12 h。

2.2 染色體數及倍性分析

對重瓣花型和單瓣花型崇明水仙各 50個根尖細胞的中期分裂相進行染色體計數,結果表明：重瓣花型有 46個細胞的染色體數為 30,占計數細胞總數的92％；單瓣花型有 48個細胞的染色體數為 30,占計數細胞總數的 96％。由圖 1可見：根據染色體的形態(tài)、長度和長短臂比,重瓣花型和單瓣花型崇明水仙體細胞的 30條染色體都可以按照每組 3條匹配為 10組,故推測它們都是 x=10的三倍體。因此,確定崇明水仙體細胞的染色體數為 2n=3x=30。

表 1 前處理液和前處理時間對崇明水仙根尖體細胞中期細胞分裂指數的影響Tab le 1 Effec t of p re-trea tm en t so lu tion and tim e on d iv ision index ofm etaphase cell in som a tic cells of root-tips of Chongm ing narc issus (N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)

圖 1 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細胞的染色體形態(tài)Fig.1 Chrom osom em orpho logy in som a tic cellsof root-tips of doub le and single flower types of Chongm ing narcissus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)

2.3 染色體核型分析

2.3.1 重瓣花型崇明水仙染色體核型分析 根據根尖體細胞染色體的配對結果對重瓣花型崇明水仙的染色體核型參數進行統計分析,結果見表 2；根據表 2數據繪制的染色體核型模式圖見圖 2。

表 2 重瓣花型崇明水仙根尖體細胞染色體的核型參數1)Tab le 2 Karyotype param eters of chrom osom es in som a tic cells of root-tips of doub le flower type of Chongm ing narc issus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)1)

圖 2 重瓣花型崇明水仙根尖體細胞染色體核型模式圖F ig.2 Karyotype d iagram of chrom osom es in som a tic cells of roottips of doub le flower type of Chongm ing narcissus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)

在 10組染色體中,第 3、6、7、9和 10號染色體為近中部著絲點染色體(臂比小于 3),其余染色體均為近端部著絲點染色體(臂比大于 3)；在第 7號染色體上有隨體,隨體長度為 0.49μm。染色體組總長度為40.47μm；長臂總長度為 30.95μm,平均長度為4.05μm。在 10組染色體中第 1號染色體的總長度最長,為 6.20μm；第 10號染色體最短,為 2.00μm；最長染色體與最短染色體長度的比值為 3.10。核型不對稱系數(A s.k)為 76.48％,相對長度系數組成為2n=30=12L+6M2+12S。分析結果顯示：重瓣花型崇明水仙根尖體細胞染色體的核型公式為 2n=3x= 30=15st+15sm(3SAT)。

由表 2還可看出：重瓣花型崇明水仙體細胞染色體的臂比變化范圍為 1.89～4.71,臂比大于 2的染色體有 9組,占全部染色體組的 90％。根據 Stebbins的核型分類標準,重瓣花型崇明水仙的體細胞的染色體核型屬于“3B”型。

2.3.2 單瓣花型崇明水仙染色體核型分析 根據根尖體細胞染色體的配對結果對單瓣花型崇明水仙的染色體核型參數進行統計分析,結果見表 3；根據表3數據繪制的染色體核型模式圖見圖 3。

表 3 單瓣花型崇明水仙根尖體細胞染色體的核型參數1)Tab le 3 Karyotype param eters of chrom osom es in som a tic cells of root-tips of single flower type of Chongm ing narcissus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)1)

在 10組染色體中,第 3、6、8、9和 10號染色體為近中部著絲點染色體(臂比小于 3),其余染色體均為近端部著絲點染色體(臂比大于 3)；在第 7號染色體上有隨體,隨體長度為 0.52μm；染色體組總長度為42.13μm；長臂總長 32.32μm,平均長度 4.21μm。在10組染色體中第1號染色體的總長度最長,為 6.58μm；第 10號染色體最短,為 2.06μm；最長染色體與最短染色體長度的比值為 3.19。核型不對稱系數(A s.k)為 76.71％,相對長度系數組成為 2n=30= 12L+3M1+3M2+12S。分析結果顯示：單瓣花型崇明水仙根尖體細胞染色體的核型公式為 2n=3x=30=15st(3SAT)+15sm。

圖 3 單瓣花型崇明水仙根尖體細胞染色體核型模式圖F ig.3 Karyotype d iagram of chrom osom es in som a tic cells of roottips of sing le flower type of Chongm ing na rc issus(N a rcissus tazetta L. var.ch inensis Roem.)

由表 3還可以看出：單瓣花型崇明水仙根尖體細胞染色體的臂比變化范圍為 1.72～5.02,臂比大于 2的染色體有 9組,占全部染色體組的 90％。根據Stebbins的核型分類標準,單瓣花型崇明水仙體細胞染色體的核型屬于“3B”型。

2.3.3 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙染色體平均核型分析 根據上述觀察和測量結果可見：重瓣花型和單瓣花型崇明水仙的根尖體細胞染色體核型間的差異不明顯,將二者的核型參數進行平均分析得到的結果見表 4,根據平均核型參數繪制的平均核型模式圖見圖4。

在 10組染色體中,第 3、6、8、9和 10號染色體為近中部著絲點染色體(臂比小于 3),其余染色體均為近端部著絲點染色體(臂比大于 3)；第 7號染色體具有隨體。染色體組總長度 41.28μm；長臂總長 31.61μm,平均長度 4.13μm。核型不對稱系數 (A s.k)為76.57％,相對長度系數組成為 2n=30=12L+6M2+ 12S。分析結果顯示：崇明水仙根尖體細胞染色體的平均核型公式為 2n=3x=30=15st(3SAT)+15sm。

由表 4還可以看出：崇明水仙根尖體細胞染色體中臂比大于 2的染色體有 9組,占全部染色體組的90％。根據 Stebbins的核型分類標準,崇明水仙體細胞染色體的核型屬于“3B”型。

表 4 崇明水仙根尖體細胞染色體的平均核型參數1)Tab le 4 Average karyotype param eters of chrom osom es in som a tic cells of root-tips of Chongm ing narc issus(N a rcissus tazetta L.var. ch inensis Roem.)1)

圖 4 崇明水仙根尖體細胞染色體平均核型模式圖F ig.4 Average karyotype d iagram of chrom osom es in som a tic cells of roo t-tips of Chongm ing narc issus(N a rcissus tazetta L.var. ch inensis Roem.)

2.3.4 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙染色體核型的比較分析 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細胞染色體核型參數的比較結果見表 5。結果表明：重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細胞染色體的核型略有差異。相同點為：都屬于典型不對稱的二型核型,染色體數和倍性相同,核型類型同屬于“3B”型,隨體均出現在第 7號染色體的短臂上,臂比大于 2的染色體組數占全部染色體組的 90％。差異在于：重瓣花型的第 7號染色體為 sm型、第 8號為 st型,而單瓣花型的第 7號染色體為 st型、第 8號為 sm型；前者的核型不對稱系數(A s.k)略小于后者；前者的相對長度系數為 12L+6M2+12S,后者的相對長度系數為 12L +3M1+3M2+12S；前者的最長染色體與最短染色體長度的比值略小于后者。綜合李懋學等[5]的研究結果,可以認為重瓣花型和單瓣花型崇明水仙具有同一起源,二者在形態(tài)特征方面的差異可能是長期進行無性繁殖和栽培選擇所形成的基因型和生態(tài)型的差異。

表 5 重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細胞染色體核型參數的比較1)Tab le 5 Com par ison of karyotype param eters of chrom osom es in som a tic cells of root-tips of doub le and single flower types of Chongm ing narcissus(N a rcissus tazetta L.var.ch inensis Roem.)1)

3 討論和結論

在植物細胞染色體核型分析過程中,前處理過程是使細胞分裂停止在中期階段而獲得較多中期分裂相的關鍵步驟,前處理同時還可以使染色體縮短變粗,便于觀察和統計。在本實驗過程中,針對不同類型水仙,前處理液和前處理時間有一定差異。前處理時間過短,染色體大部分還處于染色質狀態(tài),得不到清晰可見的染色體；前處理時間過長,造成染色體過度縮短,無法判別著絲點,也無法體現各染色體之間的差異,不能進行準確的核型分析。本實驗中,在染色體制片過程中利用對二氯苯飽和溶液前處理 12 h,能夠獲得較多的中期分裂相細胞。但在 50個中期分裂相細胞中,能夠清晰鑒別出具有 30條染色體數的細胞數未達到 100％,這可能是由于在染色體制片過程中出現重疊或斷裂所致。

核型分析結果表明：重瓣花型和單瓣花型崇明水仙根尖體細胞的染色體核型基本一致,差異較小。染色體數都為 2n=3x=30,其中包括 18條長染色體和12條短染色體,短染色體中有 3條具隨體,按照染色體長短和隨體染色體數目進行配對可以配成 10組,平均核型公式為 2n=3x=30=15st(3SAT)+15sm。根據現有研究資料可以確定崇明水仙是三倍體植物。

水仙屬植物染色體數目和倍性變化復雜：染色體基數(x)有 7、10和 11三類；除二倍體外,還存在三倍體、四倍體和六倍體；染色體數從 14～56不等[11-13]。通過細胞學觀察,一些學者認為中國水仙是三倍體植物[1,5],但是也有學者持不同觀點。曾滄江等[14]認為中國水仙是二倍體植物；李懋學等[5]發(fā)現崇明水仙的染色體數目 2n=30,并據此推斷崇明水仙為同源三倍體植物。與王瑞[15]報道的漳州水仙染色體核型相比,崇明水仙的 10組染色體組中有多組出現 3條染色體中 2條體積形態(tài)相似并與另外一條形態(tài)差異較大的現象,尤其是第 7組具隨體的 3條染色體,其中的 2條無論是長度、臂比還是隨體長度都相似,而第 3條則隨體明顯,且染色體長度在 3條染色體中最短。因此,初步推測崇明水仙是節(jié)段異源三倍體。這一結果與朱心武等[16]、莊偉建等[17]和李廣蘋[18]的研究結果一致。至于這種核型差異究竟是同源三倍體染色體之間的雜合現象,還是節(jié)段異源三倍體之間的差別,需要通過分子原位雜交和分子標記等實驗進行驗證。

由于長期以來一直進行無性繁殖,因此水仙的后代性狀相對穩(wěn)定。重瓣花型和單瓣花型崇明水仙體細胞染色體的核型差異較小,但在形態(tài)特征方面則表現出一定的差異,這可能與不同生態(tài)型的差異有關。從不同生態(tài)型的崇明水仙中選擇形態(tài)性狀較好的類型作為優(yōu)質種源進行迅速繁殖推廣,可達到對崇明水仙種源進行提純、復壯和保種的目的,具有重要理論意義。

三倍體植物屬于多倍體范疇,多倍體特性不僅體現在植株速生和營養(yǎng)物質增多上,還體現在植株的生態(tài)適應性及抗逆性增強等方面[19]。從長期的栽培歷史來看,崇明水仙具有球莖緊實、水養(yǎng)期及花期長、適應性強、對 SO2和 CO有較強抗性等特性,在形態(tài)和生理上初步顯示出多倍體的物種優(yōu)勢。目前,利用秋水仙素處理植物組織器官[20]以及原生質體融合技術在多倍體育種上都取得顯著效果[21]。多倍體育種可增加原細胞型不具有的新特性[22],可使花卉的花器官增大、色彩更艷麗或花期延長[23]。綜上所述,基于崇明水仙所具有的三倍體遺傳背景,對崇明水仙進行倍性改良具有很大的應用潛力。然而,由于崇明水仙鱗莖小、少側腳、葉片較小、花多獨枝且不易造型,因此,可以考慮采用秋水仙素處理使染色體加倍的方法誘導崇明水仙產生突變,以獲得鱗莖增大、側腳和花枝增多、花器官增大的崇明水仙品種。

不同植物都有自身最適宜的染色體倍性水平,并不是染色體數越多、倍性越高越佳。如果超過了一定的倍性限度,就會破壞植物的遺傳平衡和生理平衡,從而導致許多缺陷的產生,尤其在同源多倍體中這一現象更為突出。中國水仙是異源三倍體植物,其多倍體的誘導與二倍體的純合加倍有所區(qū)別,誘導多倍體時極易出現嵌合體,且目前已有報道的是誘導出鱗莖球大于三倍體的六倍體[15]。因此,對于崇明水仙多倍體的誘導及其最適倍性有待于進一步深入研究。

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