謝瑩珊，沈 宜，隆 霜，范維柯，姜 蓉，陳 黎

(重慶醫(yī)科大學干細胞與組織工程研究室 400016)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來中國乳腺癌發(fā)病率呈快速上升趨勢。乳腺癌的轉(zhuǎn)移是影響生存期的主要因素之一。腫瘤內(nèi)血管新生是一種病理性血管生長，與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤內(nèi)血管新生不僅為原發(fā)腫瘤生長所必須，也是腫瘤細胞向遠處轉(zhuǎn)移的必備條件之一。血管內(nèi)皮細胞是腫瘤血管新生的重要效應細胞，對腫瘤血管內(nèi)皮細胞生長機制的研究雖已進行多年，但對腫瘤細胞與周圍血管內(nèi)皮細胞之間有怎樣聯(lián)系、對腫瘤血管內(nèi)皮細胞的病理性生長的分子機制目前還不清楚。深入研究其分子機制，有助于尋找有效的靶點，特異抑制腫瘤血管內(nèi)皮細胞生長，對提高乳腺癌治療效果有重大意義。

目前對細胞分泌exosomes研究顯示，exosomes能將其攜帶的蛋白質(zhì)、mRNA及miRNA選擇性地遞送至受體細胞，在細胞間傳遞信息，在炎癥、妊娠、病原微生物轉(zhuǎn)播中發(fā)揮生物學作用。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中血管內(nèi)皮細胞往往表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)高表達[1-3]。本研究通過體外共培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(human umbilical vein endothelial cell，HUVECs)與人乳腺癌細胞株MDA-MB-231源exosomes，探討乳腺癌細胞MDA-MB-231源exosomes對血管內(nèi)皮細胞EGFR表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 HUVECs與人乳腺癌細胞株MDA-MB-231由本研究室提供，復蘇后使用。RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM高糖、新生牛血清購自美國Gibco公司，重水購自青島騰龍微波科技有限公司，分析純蔗糖購自上海生工生物有限公司，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，二辛可酸(BCA)蛋白定量試劑盒、預染蛋白標準品、Western blot試劑盒、ECL試劑盒、增強型化學發(fā)光試劑盒購自南京碧云天公司，兔抗人EGFR多克隆抗體購自美國Santa Crus，聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)購自美國Millpore公司，EGFR及GAPDH特異性引物購自成都天泰公司，RNAisoTMPlus總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、PCR擴增試劑盒購自日本Takara公司，DNA Marker、Gold view核酸染料購自北京天根公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) MDA-MB-231細胞系與HUVECs細胞系分別置于含10%新生牛血清RPMI1640與DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃、5%CO2培育箱內(nèi)孵育，0.25%胰蛋白酶消化傳代。收集培養(yǎng)2 d腫瘤細胞上清液共200 mL，-20 ℃保存。

1.2.2exosomes制備及蛋白定量 參照文獻[4]采用超速離心及密度梯度離心法提取MDA-MD-231細胞exosomes(此法為本實驗室常規(guī)提取exosomes的方法，前期實驗中已成功鑒定)，0.22 μm濾膜過濾分裝，-80 ℃保存。BCA蛋白定量法測定exosomes樣品總蛋白量，步驟按照產(chǎn)品說明書進行。

1.2.3免疫細胞化學法檢測MDA-MB-231細胞EGFR表達 取5×104/mL對數(shù)生長期細胞懸液進行爬片，每孔2 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細胞鋪滿約80%時進行免疫細胞化學染色測定。吸棄培養(yǎng)液，室溫下PBS洗2次，每次2 min；4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次3 min；3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下放置15 min，PBS洗3次，每次3 min；滴加5%牛血清清蛋白封閉液，室溫20 min；吸棄多余液體，不洗；滴加1∶40稀釋的兔抗人EGFR一抗，37 ℃孵育1 h；PBS洗3次，每次2 min；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min；PBS洗3次，每次5 min；滴加試劑SABC，37 ℃孵育20 min；PBS洗4次，每次5 min；DAB顯色：取1 mL蒸餾水，加A、B、C試劑各一滴，混合后加至玻片，室溫顯色，顯微鏡下控制反應時間；蘇木素復染2 min，自來水沖洗10 min。脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察，照相。

1.2.4Western blot法檢測MDA-MB-231細胞、exosomes及HUVECs EGFR蛋白表達 取對數(shù)生長期細胞，PBS洗3次，每瓶細胞各加入200 μL RIPA細胞裂解液和2 μL苯甲基磺酰氟(PMSF)，置冰上充分裂解，將裂解物移至不同離心管(EP)中，4 ℃，12 000 g離心30 min，收集上清液，BCA法蛋白定量。 exosomes經(jīng)超聲破碎后BCA法測蛋白濃度，各取40 μg上樣于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)；蛋白質(zhì)通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含8%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉2 h，加入兔抗人EGFR一抗(1∶200)，4 ℃過夜；加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶2 000)，室溫下結(jié)合1 h；TBST充分洗滌3次，加入ECL顯影劑，顯影定影后于凝膠成像系統(tǒng)曝光，觀察結(jié)果。

1.2.5HUVECs與exosomes共培養(yǎng)體系 常規(guī)傳代HUVECs細胞，待細胞貼壁后棄上清液，加入含終濃度為200 μg/mL的exosomes新鮮培養(yǎng)液(實驗組)，同時設(shè)置細胞無exosomes處理(對照組)，繼續(xù)置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h即可做進一步檢測。

1.2.6免疫細胞化學法檢測實驗組HUVECs EGFR的表達 方法同1.2.3。結(jié)果根據(jù)顯微鏡下細胞著色的數(shù)目評分，進行半定量計數(shù)以評價EGFR蛋白的表達。在高倍鏡下隨機選取5個視野，計算染色陽性的細胞占所計數(shù)細胞的百分比，取各視野區(qū)的平均值作為終值。

1.2.7RT-PCR法檢測MDA-MB-231細胞與實驗組HUVECs細胞 EGFR mRNA的表達 常規(guī)消化細胞，離心后棄上清液，用預冷PBS洗滌細胞2次，細胞計數(shù)，分別收集1×107個MDA-MB-231細胞和HUVECs細胞，分別加入1 mL的RNAisoTMplus提取總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,再以cDNA為模板進行PCR反應。EGFR上游引物序列：5′-CAA AGT GCC TAT CAA GTG G-3′，下游引物序列：5′-GAA TTG TTG CTG GTT GCA-3′，擴增片段長度為513 bp；GAPDH上游引物序列：5′-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3′，下游引物序列：5′-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3′，擴增片段長度為258 bp。EGFR逆轉(zhuǎn)錄反應條件37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。PCR反應條件為94 ℃ 5 min，循環(huán)1次；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min結(jié)束PCR反應。各取5 μL產(chǎn)物與1 μL 6×上樣緩沖液混勻后進行瓊脂糖凝膠電泳，100 V恒壓電泳30 min。電泳結(jié)束后取出瓊脂糖，紫外分析儀下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)成像，使用Quantity One軟件進行分析。

2 結(jié) 果

2.1免疫細胞化學法檢測MDA-MB-231細胞EGFR表達 MDA-MB-231細胞的細胞質(zhì)和細胞膜均呈現(xiàn)棕黃色顆粒均勻分布，為EGFR蛋白陽性表達，見封2圖1。

2.2Western blot法檢測MDA-MB-231細胞、exosomes及HUVECs EGFR蛋白表達 EGFR相對分子質(zhì)量為170×103，PVDF膜經(jīng)化學發(fā)光后可見MDA-MB-231細胞及exosomes的EGFR蛋白呈陽性反應帶，HUVECs呈陰性反應帶,見圖2。

1：MDA-MB-231細胞；2：MDA-MB-231細胞源exosomes；3：HUVECs。

2.3免疫細胞化學法檢測HUVECs EGFR的表達 實驗組HUVECs與exosomes混合培養(yǎng)24 h后，鏡下可見部分HUVECs細胞質(zhì)有淡黃色或棕黃色顆粒，EGFR陽性表達率為(21.4±3.1)%，與對照組(無EGFR蛋白表達)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見插Ⅰ圖3。

2.4RT-PCR法檢測MDA-MB-231細胞與實驗組HUVECs細胞EGFR mRNA的表達 MDA-MB-231細胞在513 bp處可見一條明顯的擴增條帶，而實驗組HUVECs細胞未見EGFR 513 bp的擴增產(chǎn)物，見圖4。

1：DNA 標記物；2：MDA-MB-231細胞；3：實驗組HUVECs細胞。

3 討 論

EGFR或HER-1/erbB1是首先發(fā)現(xiàn)的HER/erbB家族跨膜受體酪氨酸激酶成員，該家族成員還包括HER-2/erbB2、HER-3/erbB3、HER-4/erbB4，有高度同源的酪氨酸序列和相似的結(jié)構(gòu)特征[5]。EGFR基因位于7P11-13，編碼蛋白相對分子質(zhì)量為170×103，是一種跨膜分布的細胞表面?zhèn)鞲衅?。EGFR在非活性狀態(tài)下是單體，與配體結(jié)合后形成同源或異源二聚體，細胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶活化，酪氨酸殘基位點發(fā)生自身磷酸化，進而激活Ras-Raf-MAPK、PI3K/AKT、JAK/STAT等多條信號轉(zhuǎn)導途徑[6]，將信號由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)到細胞核內(nèi)，啟動DNA復制、引起細胞增殖、抑制細胞凋亡、促進腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移等。

EGFR表達異常主要表現(xiàn)為EGFR過表達和(或)突變，研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在多種腫瘤中有不同程度的表達，頭頸部鱗癌中表達率為90%～100%，肺癌中表達率為40%～80%，腎癌中表達率為50%～90%，結(jié)直腸癌中表達率為25%～77%，卵巢癌中表達率為25%～70%，前列腺癌中表達率為39%～47%，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達率為40%～63%，乳腺癌中表達率為14%～90%[7]。EGFR的過表達和(或)突變與腫瘤細胞增殖、新生血管形成、侵襲、轉(zhuǎn)移、抗凋亡及對放療耐受等密切相關(guān)。

有研究表明，人體正常血管內(nèi)皮細胞不表達EGFR，表皮生長因子(EGF)對體外培養(yǎng)的HUVECs增殖遷移沒有影響，而當HUVECs與高表達EGFR的人表皮鱗狀細胞癌A431細胞混合培養(yǎng)后，EGF的刺激可提高HUVECs的遷移能力，并且在EGF的刺激下，A431細胞通過旁分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和IL-8這兩種正向調(diào)節(jié)血管生成因子來刺激內(nèi)皮細胞增殖[8]。另一體外研究發(fā)現(xiàn)當腫瘤細胞分泌大量轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-α和EGF時會發(fā)生腫瘤血管生成作用，此時在血管內(nèi)皮細胞上可發(fā)現(xiàn)正常時并不表達的EGFR[9]，但是腫瘤血管內(nèi)皮細胞異常表達EGFR的機制仍不十分清楚。

exosomes是由細胞內(nèi)多泡體(multivesicular body,MVB)與質(zhì)膜融合后釋放到細胞外的一種直徑為30～100 nm的膜性小囊泡。當細胞經(jīng)內(nèi)吞途徑將外來內(nèi)吞物質(zhì)轉(zhuǎn)變成早期核內(nèi)體(early endosome，EEs)時，其內(nèi)可包含外來抗原物質(zhì)，隨后EEs的膜囊內(nèi)陷、突入，形成多個囊泡狀結(jié)構(gòu)，并選擇性接受細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白成分及脂類，此時的EEs被稱為晚期核內(nèi)體(late endosomes，LEs)，即多泡體(MVB)，囊泡狀結(jié)構(gòu)稱為exosomes。MVB移向質(zhì)膜并與質(zhì)膜融合后將exosomes釋放至細胞外。exosomes通常是從細胞培養(yǎng)的上清液或腫瘤組織的各種滲出液中分離，在電鏡下顯示為脂質(zhì)雙分子的扁平或球形小體，可以懸浮于蔗糖密度梯度溶液中，因此，通過超速離心及蔗糖密度梯度離心即可將其他雜質(zhì)與exosomes分離開，本課題組在前期實驗中采用此法分離并已成功鑒定腫瘤細胞來源的exosomes[4]。exosomes主要是由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)構(gòu)成，目前通過蛋白質(zhì)組學方法對不同細胞來源的exosomes的研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的exosomes中蛋白質(zhì)不同，主要分為普通蛋白質(zhì)和細胞特異性蛋白質(zhì)[10]。其中特異性蛋白質(zhì)牽涉到來源細胞的功能，而exosomes的功能亦取決于來源細胞[11]。在本實驗中，用Western blot法檢測高表達EGFR的乳腺癌MDA-MB-231細胞來源的exosomes也同時表達EGFR。exosomes被釋放至細胞外后選擇性地與受體細胞結(jié)合。目前exosomes與受體細胞結(jié)合的方式仍不十分清楚，國外研究者提出3種假設(shè)[12-14]：(1)exosomes的膜蛋白與細胞表面的特異性受體結(jié)合從而激活細胞內(nèi)信號；exosomes膜蛋白被蛋白酶水解后的蛋白片段亦可作為可溶性配體與受體細胞表面的受體結(jié)合。(2)與受體細胞膜直接融合并將內(nèi)容物釋放至受體細胞的細胞液中，蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)exosomes含有大量的促融合蛋白——CD9[15]。與受體細胞膜融合后可改變受體細胞的膜蛋白表達和脂質(zhì)成分，從而影響和改變其生物學功能，釋放內(nèi)容物(如蛋白、mRNA或miRNA)至受體細胞，可激活多種細胞信號。(3)被受體細胞內(nèi)吞并再次釋放至鄰近細胞發(fā)揮其生物學效應。

細胞間的相互作用在腫瘤進展、血管生成和侵襲中起至關(guān)重要的作用[16]。為了探討exosomes在腫瘤微環(huán)境中的作用，在實驗中將MDA-MB-231細胞來源的exosomes與HUVECs共培養(yǎng)，觀察exosomes攜帶的EGFR在二者之間的傳遞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濃度為200 μg/mL的exosomes與HUVECs共培養(yǎng)24 h后，免疫細胞化學顯示部分HUVECs細胞胞質(zhì)有淡黃色或棕黃色顆粒，EGFR陽性表達率為(21.4±3.1)%。提示原本不表達EGFR的正常HUVECs已經(jīng)開始異常表達EGFR。隨后，采用RT-PCR法分別檢測MDA-MB-231細胞與HUVECs EGFR的mRNA表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細胞的EGFR mRNA表達為陽性，經(jīng)exosomes處理24 h后HUVECs的EGFR mRNA表達仍然為陰性，進一步證實EGFR是由exosomes介導傳遞至HUVECs，而不是其內(nèi)源性基因表達。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示MDA-MB-231細胞源exosomes攜帶癌基因EGFR，并可介導其向周圍血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移，這可能是乳腺癌組織中血管內(nèi)皮細胞異常表達EGFR的一種方式，將為今后的乳腺癌生物診斷和治療提供新的靶點。

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