申 跡,項錦銀△,寇 巍，洪蘇玲

(1.重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院眼耳鼻咽喉科 401220；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科 400016)

慢性鼻-鼻竇炎的病理生理學機制到目前為止并未被充分認識，而且，被認為是多因素共同作用的結果。宿主的遺傳背景、免疫功能的紊亂以及外界環(huán)境因素是慢性鼻-鼻竇炎發(fā)生、發(fā)展的重要誘因。最近研究顯示細菌的定植，尤其是細菌產物，如金黃色葡萄球菌腸毒素可能參與了慢性鼻-鼻竇炎發(fā)病[1-2]。

金黃色葡萄球菌腸毒素可以引起多種人類的感染性疾病[3]，如食物中毒、新生兒壞死性皮炎、毒性休克綜合征、壞死性出血性肺炎和皮膚、關節(jié)的感染等。金黃色葡萄球菌腸毒素在引起感染的同時可以作為超抗原與T淋巴細胞的MHC-Ⅱ分子Vβ受體區(qū)相結合引起T淋巴細胞的高效克隆，誘導免疫應答，而不需要特異性的抗原提呈、識別過程[4]。有研究結果發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C、D(sea,seb,sec,sed)與慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyposis,CRSsNP)和慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyposis,CRSwNP)的發(fā)病相關，提示金黃色葡萄球菌腸毒素參與了鼻-鼻竇黏膜的炎癥反應[5-6]。本研究通過PCR技術首次檢測國人慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉和慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者鼻腔金黃色葡萄球菌腸毒素基因的攜帶情況，探討與國人慢性鼻-鼻竇炎發(fā)病相關的金黃色葡萄球菌腸毒素基因類型。

1 資料與方法

1.1一般資料 2010年6月至2011年6月在重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科及重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科住院接受功能性鼻竇內窺鏡手術治療的慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉、慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉及鼻中隔偏曲患者，以中鼻道黏膜拭子金黃色葡萄球菌培養(yǎng)陽性的患者作為研究對象，共分為3組。慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉組(CRSwNP組)：110例，其中，男60例，女50例，平均年齡(38.54±11.36)歲，病程2～30年，平均病程(8.52±7.21)年。依照2007歐洲鼻-鼻竇炎鼻息肉診療意見書中的診斷標準[1]：(1)需要大于或等于2條下述癥狀：流涕[前鼻孔和(或)后鼻孔膿性分泌物]、鼻阻塞、嗅覺減退或喪失、面頰部疼痛/腫脹感，癥狀持續(xù)12周以上；(2)內窺鏡檢查證實單側和(或)雙側中鼻道有息肉，源于中鼻道的膿性分泌物，源于中鼻道的黏膜水腫或阻塞；(3)CT鼻-鼻竇炎的影像學表現(xiàn)：竇口鼻道復合體和(或)鼻竇黏膜增厚，鼻中隔無偏曲。慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉組(CRSsNP組)：32例，其中，男18例，女14例，平均年齡(36.15±12.27)歲，病程1～30年，平均病程(8.43±6.56)年。依照2007歐洲鼻-鼻竇炎鼻息肉診療意見書中的診斷標準：(1)需要大于或等于2條下述癥狀，流涕[前鼻孔和(或)后鼻孔膿性分泌物]、鼻阻塞、嗅覺減退或喪失、面頰部疼痛/腫脹感，癥狀持續(xù)12周以上；(2)內窺鏡檢查排除單側和(或)雙側中鼻道息肉，可以有源于中鼻道的膿性分泌物，源于中鼻道的黏膜水腫或阻塞；(3)CT鼻-鼻竇炎的影像學表現(xiàn)，竇口鼻道復合體和(或)鼻竇黏膜增厚，鼻中隔無偏曲。鼻中隔偏曲組(對照組)：44例，其中，男24例，女20例，平均年齡(30.54±10.36)歲，病程2～20年，平均病程(6.83±5.31)年。本實驗結合鼻塞、頭痛、鼻犁氏區(qū)出血等臨床癥狀，變應原皮膚試驗，鼻內窺鏡和鼻竇CT檢查進行診斷，排除慢性鼻-鼻竇炎和鼻息肉。為了使結果具有可比性，能夠較真實反映慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉、慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉及鼻中隔偏曲患者金黃色葡萄球菌腸毒素基因的攜帶情況，所有患者過去均未曾接受抗菌藥物、組胺拮抗劑、鼻腔沖洗和鼻腔糖皮質激素等保守治療；無藥物、食物過敏史，無哮喘史、真菌感染史；且均無鼻腔手術史，無高血壓、糖尿病、高脂血等其他器官系統(tǒng)的疾病。

1.2研究方法 對3組患者的中鼻道黏膜拭子進行金黃色葡萄球菌分離培養(yǎng)，并根據美國臨床實驗室標準化協(xié)會的檢驗標準[7]，經法國Bio-Merieux公司的GPI系統(tǒng)鑒定為金黃色葡萄球菌，再應用PCR檢測每例患者金黃色葡萄球菌樣本18種腸毒素基因的攜帶情況，包括sea、seb、sec、sed、see、seg、sei、sem、sen、seo、seu、sej、sep、seq、she、sek、sel、ser。

1.2.1研究試劑及儀器設備 細菌鑒定儀：Vitek32全自動微生物分析儀(法國)；PCR擴增儀:T-gradient Biometra(德國)；凝膠電泳儀：DYY-10C(北京)；PCR試劑：購于TaKaRa公司。

1.2.2引物設計與合成 根據 Gen Bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的金黃色葡萄球菌18種腸毒素的基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件及參考文獻[8],引物由上海生工生物工程公司合成,引物序列見表1。

1.2.3DNA的提取 取每例患者中鼻道黏膜拭子分離培養(yǎng)出的金黃色葡萄球菌菌落放入400 μL雙蒸水中混勻,100 ℃煮沸15～30 min后,10 000 r/min離心 5 min,吸取3 μL上清液作為PCR擴增模板。

1.2.4PCR擴增體系及反應條件 擴增反應體系：緩沖液5 μL，Taq酶0.25 μL，dNTP 3 μL，引物1 μL，模板1 μL,再加滅菌去離子水至50 μL。擴增金黃色葡萄球菌腸毒素基因的熱循環(huán)參數為：95 ℃預變性 4 min,95 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,循環(huán)30次,72 ℃延伸 7 min。

1.2.5瓊脂糖凝膠電泳 170 mg瓊脂糖粉末與17 mLTBE緩沖液混合加熱煮沸,冷卻至60 ℃加入溴乙錠1.5 μL制備成1%的瓊脂糖凝膠。1 μL上樣緩沖液與6 μL PCR擴增產物混合后加入1%瓊脂糖凝膠孔,水平式電泳槽電壓100 V,電流80 mA,電泳時間為30 min。300 nm紫外燈觀察結果,并用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.3統(tǒng)計學處理 應用費歇爾精確檢驗及χ2檢驗對實驗數據進行統(tǒng)計學分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

3個實驗組患者金黃色葡萄球菌腸毒素基因的陽性檢出率見圖1。110例CRSwNP組患者中有92例患者至少檢出1種腸毒素基因(92/110,84%),CRSsNP組為(30/32,92%)，對照組患者為(36/44，82%)，但3組陽性檢出率的χ2檢驗差異均無統(tǒng)計學意義(CRSwNP組與對照組：P=0.25；CRSsNP組與CRSwNP組：P=0.22；CRSsNP組與對照組：P=0.23)。

表1 金黃色葡萄球菌腸毒素基因引物序列

表2統(tǒng)計了3組患者中每一種腸毒素基因的陽性檢出例數：沒有任何一種腸毒素基因在所有患者中均陽性檢出；3組患者陽性檢出例數均較高的幾種腸毒素基因為：seg、sem、sen、sei、seo、seu,組間比較差異無統(tǒng)計學意義。通過費歇爾精確檢驗分析CRSwNP組與對照組每一種腸毒素基因陽性檢出例數的差異，發(fā)現(xiàn)16例CRSwNP組患者表達腸毒素seq基因，而對照組無陽性檢出，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.03)；而CRSsNP組與CRSwNP組，CRSsNP組與對照組的每一種腸毒素基因陽性檢出例數比較差異均無統(tǒng)計學意義(表2中未列出)。3組患者均未檢測出腸毒素基因：sek(圖2、3)。

表2 3組患者金黃色葡萄球菌腸毒素基因檢測結果

圖1 3組患者金黃色葡萄球菌腸毒素基因的

圖2 金黃色葡萄球菌腸毒素基因擴增產物

圖3 金黃色葡萄球菌腸毒素基因擴增產物電泳圖

3 討 論

慢性鼻-鼻竇炎是上呼吸道黏膜的慢性炎癥，其患病率占總人口的大約15%，對患者的生活質量產生一定程度的影響，并造成嚴重的社會經濟負擔。

歐洲鼻-鼻竇炎、鼻息肉診療指南對慢性鼻-鼻竇炎的定義做了一個比較全面的描述：慢性鼻-鼻竇炎是鼻腔和副鼻竇黏膜的慢性炎癥反應，分為慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉和慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉2個亞型，患者的癥狀持續(xù)時間大于12周，而且鼻竇內窺鏡檢查及鼻竇CT檢查結果均有特征性的表現(xiàn)。慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉通常占慢性鼻-鼻竇炎患者的20%。

目前，基因庫(Genbank)已經證實的金黃色葡萄球菌腸毒素基因有18個：sea、seb、sec、sed、see、seg、sei、sem、sen、seo、seu、sej、sep、seq、she、sek、sel、ser。那么，除了腸毒素A、B、C、D，其他腸毒素是否亦與慢性鼻-鼻竇炎的發(fā)病相關。

本研究中慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉,慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉組及鼻中隔偏曲組金黃色葡萄球菌腸毒素基因的陽性檢出率分別為84%、94%、82%。國內學者從醫(yī)院呼吸內科患者的痰液中分離培養(yǎng)出的金黃色葡萄球菌，檢測其腸毒素基因，陽性率為9.48%；趙建等[9]從醫(yī)院食物中毒患者的嘔吐物及相關食品標本中分離培養(yǎng)出金黃色葡萄球菌，腸毒素基因的陽性檢出率為56.2%，均遠低于本實驗中各組患者金黃色葡萄球菌腸毒素基因的陽性檢出率，提示金黃色葡萄球菌在宿主鼻腔的定植和克隆、腸毒素基因的翻譯和表達及其與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用是鼻腔、鼻竇黏膜慢性炎癥過程的重要因素。

本研究首次發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌腸毒素基因seq在國人慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者中的陽性檢出率與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義；金黃色葡萄球菌腸毒素基因seg、sem、sen、sei、seo、seu在3組中相對其他腸毒素基因有較高的陽性檢出例數，但差異無統(tǒng)計學意義。以前實驗研究較多的腸毒素sea、seb、sec、sed，其基因在3組中的陽性檢出例數均較低，差異無統(tǒng)計學意義。最近研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌腸毒素seq在食物中毒的發(fā)病中有一定作用，但其與慢性鼻-鼻竇炎發(fā)病機制的關系還有待在本實驗的基礎上進一步深入探討[10-11]。

近年，歐美及國內有學者提出“超抗原”假說[12]，認為金黃色葡萄球菌腸毒素作為細菌超抗原產物能夠與宿主免疫系統(tǒng)相互作用，激活并增殖人體CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、抗原遞呈細胞、嗜酸性粒細胞和上皮細胞產生相應的細胞因子、炎性介質，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，導致鼻腔外側壁黏膜的炎性浸潤、組織水腫及鼻黏膜假復層纖毛柱狀上皮的毀損[13]。因此，金黃色葡萄球菌腸毒素超抗原可能是慢性鼻-鼻竇炎(伴和不伴鼻息肉)的始發(fā)因素，而且在慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者鼻黏膜中發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌腸毒素特異性T淋巴細胞MHC-Ⅱ分子Vβ受體及IgE更支持了這一病理機制[14]。

本研究檢測的是金黃色葡萄球菌腸毒素基因，而并非腸毒素蛋白本身?；蛟诜g、表達為蛋白質的過程中會受到機體內環(huán)境及外界多種因素的影響，也就是說，雖然在本實驗的菌株中檢測到某種腸毒素基因的存在，但在復雜的鼻腔微環(huán)境中由于受到多種因素的調控，并不是金黃色葡萄球菌所攜帶的每個腸毒素基因都會表達為具有功能的毒素蛋白。最后這些基因是否會轉錄、翻譯成腸毒素蛋白質，而且表達的量是多少，目前，蛋白質組學方法的靈敏度還不能夠完整、準確地檢測出。因此，對慢性鼻-鼻竇炎(伴和不伴鼻息肉)中實際表達存在的金黃色葡萄球菌腸毒素蛋白質譜的分析將更有意義，這也是作者今后的探索和挑戰(zhàn)[15]，而且隨著金黃色葡萄球菌在宿主免疫系統(tǒng)及局部微環(huán)境作用下產生的各種基因突變，更多新的腸毒素基因也有待去發(fā)現(xiàn)[16]。

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