中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院內(nèi)分泌科（沈陽110000） 王 露 張 微 索琳娜

“脂毒性”是指血循環(huán)中游離脂肪酸濃度過高以及脂肪組織分泌的各種脂肪素含量增高所引起的致糖尿病作用。脂毒性對胰島β細(xì)胞的數(shù)量和功能均可產(chǎn)生不利影響。Moore等［1］指出軟脂酸鹽可以抑制胰島素分泌。其機(jī)制可能與氧化應(yīng)激有關(guān)，而應(yīng)用抗氧化劑能否減輕此反應(yīng)也不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用軟脂酸培養(yǎng)胰島細(xì)胞，并進(jìn)一步探討NADPH－氧化酶抑制劑二苯基碘（DPI）對此的影響。

材料與方法

1 材 料 細(xì)胞株和試劑：大鼠胰島細(xì)胞株INS－1（購自武漢大學(xué)細(xì)胞庫），軟脂酸購于美國Calbiochem公司，DPI購于美國CalBiochem公司；放射免疫法測定試劑盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所。

2 方 法

2．1 細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠胰島細(xì)胞株INS－1培養(yǎng)于含10%%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中（含10%mmol／L Hepes，1mmol／L丙酮酸鈉，50μmol／L 2－ 巰基乙醇，100U／ml青 霉 素 和 100μg／ml 的 鏈 霉 素 ），置 于37%℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，將處于對數(shù)生長期貼壁生長的INS－1細(xì)胞用0．25%胰酶消化離心，用RPMI1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，并校正細(xì)胞濃度至1×106／ml。分別將INS－1細(xì)胞按1×105個(gè)／ml種植于24孔板內(nèi)，分為①正常對照組；②軟脂酸組0．25mmol／L處理24h；③軟脂酸0．25mmol／L DPI處理組．孵育24h收集上清液，－20°C保存。

2．2 胰島素含量：采用放免法測定。

2．3 GSH－Px、MDA含量：采用比色法測定。

2．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS11．5對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差（ANOVA）分析。

結(jié) 果

1 胰島素含量的比較：單用軟脂酸培養(yǎng)組的胰島素水平較對照組明顯降低（P﹤0．05），加用DPI干預(yù)后胰島素水平較單用軟脂酸組明顯增加（P﹤0．05），見附表。

2 GSH－Px、MDA含量的比較：單用軟脂酸培養(yǎng)組的GSH－Px含量較對照組明顯降低（P﹤0．05），加用DPI干預(yù)后明顯改善（P﹤0．05）。與對照組比較，單用軟脂酸培養(yǎng)組的MDA含量明顯增加（P﹤0．05），經(jīng)DPI干預(yù)后明顯得到抑制（P ﹤0．05），見附表。

附表 各組胰島素及GSH－Px、MDA含量的比較

討 論

本研究應(yīng)用軟脂酸培養(yǎng)胰島細(xì)胞發(fā)現(xiàn)胰島素水平明顯降低，進(jìn)一步證明了游離脂肪酸對胰島細(xì)胞脂毒性的作用，脂毒性可以誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡［2］，影響胰島素分泌。Rao等［3］也發(fā)現(xiàn)將大鼠胰腺B細(xì)胞置入含有過氧化氫的環(huán)境中培養(yǎng)后，其凋亡數(shù)量較正常對照組明顯增加，過氧化氫濃度越高，凋亡數(shù)量越多。這其中的機(jī)制，目前比較公認(rèn)的是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激［4，5］。胰島是所有組織中對氧化應(yīng)激最敏感的組織，胰島中抗氧化酶的含量在所有組織中是最低的。本實(shí)驗(yàn)也研究發(fā)現(xiàn)軟脂酸培養(yǎng)組的GSH－Px含量明顯減低，MDA含量明顯增加，表明軟脂酸組氧化應(yīng)激水平明顯增加。氧化應(yīng)激時(shí)過剩的活性氧族可以直接對脂質(zhì)、蛋白、溶酶體、DNA造成氧化損傷，大量氧自由基可使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，線粒體膜形狀改變，導(dǎo)致線粒體功能障礙，生成減少，使質(zhì)膜和肌漿網(wǎng)膜的鈣泵失活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子增多，激活磷脂酶活性，使膜磷脂分解，導(dǎo)致B細(xì)胞凋亡。

抗氧化劑的應(yīng)用是否能保護(hù)胰島細(xì)胞功能，到目前為止國際上也開展了各種研究，有學(xué)者用不同濃度的自由基清除劑MIC－186處理后，其抗胰腺B細(xì)胞凋亡的作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系，提示MIC－186對胰腺B細(xì)胞有保護(hù)作用［3］。此外Piro等［6］也研究發(fā)現(xiàn)能抑制活性氧簇的煙酰胺可以抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡。國內(nèi)有學(xué)者應(yīng)用N－乙酰半胱酸進(jìn)行對胰島細(xì)胞的保護(hù)研究［7］，而氧化酶抑制劑DPI是否能保護(hù)胰島細(xì)胞，目前研究很少，動脈粥樣硬化是糖尿病的嚴(yán)重及常見并發(fā)癥，糖尿病的主要臨床特點(diǎn)是血糖升高，而高糖可以刺激血管產(chǎn)生氧化應(yīng)激，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，誘發(fā)動脈粥樣硬化。探討氧化應(yīng)激產(chǎn)生的機(jī)制，抑制活性氧的產(chǎn)生，對于防止糖尿病并發(fā)動脈粥樣硬化有十分重要的作用。NADPH氧化酶（NOX）是血管內(nèi)皮細(xì)胞中活性氧產(chǎn)生的主要來源，而DPI是NADPH氧化酶的抑制劑。在本實(shí)驗(yàn)中就發(fā)現(xiàn)加入DPI培養(yǎng)后，GSH－Px含量明顯增加，MDA含量明顯降低。

本研究發(fā)現(xiàn)NADPH－氧化酶抑制劑二苯基碘（DPI）顯著改善了由軟脂酸造成的胰島細(xì)胞分泌減少和氧化應(yīng)激水平增加，這不僅說明氧化應(yīng)激在胰島功能損傷中起一定作用，同時(shí)也為改善胰島功能損傷的治療提供了一條思路。

［1］ Moore PC，Ugas MA，Hagman DK，et al．Evidence against the involvement of oxidative stress in fatty acid inhibition of insulin secretion［J］．Diabetes，2004，53：2610－2616．

［2］ Unger RH，Zhou YT．Lipotoxicity of beta cells in obesity and other causes of fatty acid spillover［J］．Diabetes，2001，50（suppl 1）：s118－s121．

［3］ Rao P，Maeda H，Yutong X，et al．Protective effect of a radical scavenger，MCI－186on islet cell damages induced by oxidative stress［J］．Transplant Proc，2005，37：3457－3458．

［4］ Hansen M．Connecting endoplasmic reticulum stress to autophagy by unfolded protein response and Ca2＋［J］．Cell Death and Differentiation，2007，14：1576－1582．

［5］ Scherz－Shouval R，Elazar Z．ROS mitochondria and the regulation of autophagy［J］．Trends Cell Biol，2007，17：422－427．

［6］ Piro S，Anello M，Dipietro C，et al．Chronic exprosure to free fatty acids or high glucose induces apoptosis in rat pancreatic islets：possible role of oxidative stress［7］．Metabolism，2002，51：1340－1347．

［7］ 王 露，張 微，彭觀景，等．N－乙酰半胱酸對軟脂酸培養(yǎng)中胰島細(xì)胞的影響．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2011，40：785－786．