李國(guó)宏， 王 偉， 趙同海

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091)

不同地區(qū)蕭氏松莖象遺傳多樣性的RAPD分析

李國(guó)宏， 王 偉， 趙同海

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091)

以蕭氏松莖象7個(gè)地理種群的基因組DNA為材料，對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)分析，從80個(gè)引物中篩選出39個(gè)穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的引物。7個(gè)地理種群共擴(kuò)增出489條擴(kuò)增條帶，每條引物平均可以得到12.5條擴(kuò)增條帶，其長(zhǎng)度從250～2 000 bp不等，其中443條(90.6%)擴(kuò)增條帶為多態(tài)性條帶，平均每條引物可得到11.4條多態(tài)性條帶。通過(guò)公式計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)、遺傳距離、及Nei’s遺傳距離，結(jié)果表明:蕭氏松莖7個(gè)地理種群之間的遺傳距離指數(shù)的變異范圍為0.403 7～0.484 4，遺傳相似性指數(shù)為0.515 6～0.596 3，平均遺傳距離指數(shù)為0.444 1；其Shannon’s信息指數(shù)為0.588 6～0.625 7，Nei’s遺傳距離為0.009 0～0.030 2；表明蕭氏松莖象種群間存在一定的遺傳多樣性。通過(guò)UPGMA聚類(lèi)分析，將7個(gè)蕭氏松莖象地理種群劃分為4個(gè)聚類(lèi)簇。分析表明，蕭氏松莖象7個(gè)地理種群存在豐富的遺傳多樣性，其遺傳分化與地理位置有一定的相關(guān)性。

蕭氏松莖象；地理種群；遺傳差異；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA

蕭氏松莖象Hylobitelus xiaoiZhang屬鞘翅目Coleptera象蟲(chóng)科Сurculionidae，是1988年發(fā)現(xiàn)的一種新的松樹(shù)蛀干害蟲(chóng)[1]。主要寄主為濕地松、火炬松，馬尾松、華山松和黃山松。對(duì)蕭氏松莖象危險(xiǎn)性的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果表明:蕭氏松莖象在我國(guó)屬于接近高度危險(xiǎn)的森林有害生物[2]。該蟲(chóng)在我國(guó)的發(fā)生歷史不算很長(zhǎng),但其危害呈迅速蔓延之勢(shì)[3]，而且還有進(jìn)一步擴(kuò)散可能，目前主要集中在江西、貴州、湖南、湖北、廣西、廣東、福建7省，給我國(guó)南方的松林資源構(gòu)成較大的潛在威脅，也嚴(yán)重威脅到了這些森林的健康[4]。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(Random Amplif i ed Polymorphic DNA ,簡(jiǎn)稱(chēng) RAPD) 技術(shù)是 Williams 和Welsh 研究小組于1990 年同時(shí)提出的一項(xiàng)DNA 多態(tài)檢測(cè)新技術(shù),是一項(xiàng)建立在PСR 基礎(chǔ)上的DNA指紋技術(shù)[5]。該技術(shù)使用一系列的隨機(jī)引物可檢測(cè)到覆蓋整個(gè)基因組范圍的遺傳改變,而無(wú)需先了解被測(cè)基因組相關(guān)分子生物學(xué)信息。作為一項(xiàng)新興技術(shù),RAPD 也被引入到昆蟲(chóng)學(xué)的研究領(lǐng)域中，廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)遺傳多樣性的研究。國(guó)內(nèi)外利用RAPD技術(shù)研究昆蟲(chóng)遺傳變異、分類(lèi)進(jìn)化的報(bào)道，已涉及鱗翅目、同翅目、雙翅目、直翅目、鞘翅目等許多目、科[6-14]，但對(duì)蕭氏松莖象的RAPD研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，本文應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)蕭氏松莖象7個(gè)地理種群進(jìn)行了研究，以期初步了解不同地域蕭氏松莖象種群的遺傳結(jié)構(gòu)信息，為今后進(jìn)一步研究環(huán)境或農(nóng)藥等因素對(duì)蕭氏松莖象遺傳結(jié)構(gòu)的影響以及對(duì)蕭氏松莖象的綜合治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試材料的分布

2007年7月至2008年8月期間，在我國(guó)福建寧化、廣東英德、廣西臨桂、貴州都勻、江西永修、湖南東安和湖北荊門(mén)七地區(qū)進(jìn)行了蕭氏松莖象幼蟲(chóng)標(biāo)本的調(diào)查收集，采集的幼蟲(chóng)用無(wú)水乙醇保存(見(jiàn)表1)。

表1 用于DNA抽提和RAPD分析的蕭氏松莖象標(biāo)本及其采集地信息Table 1 Distribution, locality , altitude and hosts of 7 populations of H. xiaoi

1.1.2 引物

使用80個(gè)10 bp的隨機(jī)引物(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn))對(duì)蕭氏松莖象總DNA進(jìn)行PСR擴(kuò)增以檢測(cè)其有效性。其中39條引物可以產(chǎn)生可重復(fù)的清晰的多態(tài)電泳條帶，因而被選擇來(lái)作為進(jìn)一步分析的引物(見(jiàn)表2)。

1.2 方 法

1.2.1 蕭氏松莖象總DNA提取和檢測(cè)

每種樣品選取蕭氏松莖象幼蟲(chóng)10只，使用T?ANGEN 生產(chǎn)的 T?ANamp Genomic DNA Kit動(dòng)物細(xì)胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒分別提取總DNA，并使用Thermo 公司 NanoDrop 1000分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA的純度和濃度，然后將10份DNA進(jìn)行混合使各樣品終濃度相同。以此DNA樣品進(jìn)行RAPD分析。

1.2.2 RAPD-PСR反應(yīng)體系和條件

通過(guò)對(duì)DNA稀釋倍數(shù)、dNTP濃度、Taq酶量、退火溫度等的優(yōu)化，最終選定PСR擴(kuò)增體系為：10×Buffer 5 μL，總 DNA 模板 180 ng，dNTP Mix(10 mmol) 1 μL；RAPD 引 物 (10 μmol)各 1 μL；Taq酶 (2.5 U/μL)0.4 μL，加 ddH20 至總體積為 50 μL。PСR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 預(yù)變性5 min；變性94 ℃30 s，退火 37 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 2 min；45 個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸15 min。反應(yīng)在Effendorf公司生產(chǎn) 的 PСR 儀 (Biometra Tgradient Thermocycler)上進(jìn)行。

擴(kuò)增產(chǎn)物用含EB(0.5 μg/mL)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

擴(kuò)增的DNA片段出現(xiàn)頻率小于0.99的條帶為多態(tài)性條帶。多態(tài)性條帶比率=多態(tài)性條帶數(shù)/檢測(cè)到的總擴(kuò)增條帶數(shù)。將電泳圖譜上清晰且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶賦值為“1”，同一位置無(wú)帶的賦值為“0”，由此形成二元數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)各條引物的擴(kuò)增條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)，所得數(shù)據(jù)使用S?MQUAL(Similarity for Qualitative Data)法 進(jìn) 行Dice相似系數(shù)的分析，其相似性系數(shù)應(yīng)用NTSYS-pc2.10軟件進(jìn)行UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)聚類(lèi)分析[15]，并計(jì)算各樣品間的遺傳距離，繪制樣品間的親緣關(guān)系聚類(lèi)樹(shù)形圖。同時(shí)使用POPGEN32軟件[16]統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)帶數(shù)量，計(jì)算Neil’s基因多樣性(H)和Shannon信息多樣性指數(shù)(?)。根據(jù)基因頻率矩陣，利用POPGEN32軟件計(jì)算總體遺傳多樣性(Ht)、種群平均遺傳多樣性(Hs)、基因分化系數(shù)(Gst)和基因流(Nm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕭氏松莖象總DNA的純度和濃度

所有樣品DNA的OD260/OD280均為1.8～2.0之間。適合進(jìn)一步的RAPD-PСR的要求，所提取的DNA濃度為186～357 ng/μL。

2.2 RAPD圖譜和多態(tài)性

使用39條隨機(jī)引物對(duì)7個(gè)地理種群進(jìn)行擴(kuò)增分析，共獲得489條擴(kuò)增條帶，每條引物平均可以得到12.5條擴(kuò)增條帶，其中443條擴(kuò)增條帶為多態(tài)性條帶，其所占比例從42.9%(F2)到最高的 100%(A1、A8、B2、B5、С1、С7、D1、D6、E8、F9、G10、H2、H4、H9)，總計(jì)達(dá)到 90.6%(見(jiàn)表2)。其長(zhǎng)度從250 bp到2 000 bp不等，主要分布在400 bp到1 500 bp之間。每條引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)在5條(G5)到19條(A1)之間。每個(gè)地理種群均含有特異的擴(kuò)增產(chǎn)物以區(qū)別于其他地理種群。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蕭氏松莖象的遺傳背景比較復(fù)雜，有較高的遺傳多樣性，引物F2擴(kuò)增的結(jié)果就是典型的例子(見(jiàn)圖1)。

圖1 引物F2擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖像Fig. 1 Result of PCR amplification by using primer F2

表2 RAPD中39個(gè)隨機(jī)引物的擴(kuò)增效果Table 2 Sequences and amplifications of 39 random primers

2.3 不同地理種群間的遺傳距離和遺傳相似指數(shù)及聚類(lèi)分析

用NTSYS-pc2.10得到蕭氏松莖象7個(gè)地理種群Dice相似系數(shù)，計(jì)算它們之間的遺傳距離，其變化范圍為0.403 7～0.484 4，平均值為0.444 1。其中福建寧化種群和江西永修種群之間的遺傳距離最大(0.484 4)，遺傳距離最小的是廣西臨桂種群和貴州都勻種群(0.403 7)。7個(gè)地理種群間的遺傳相似度范圍為0.515 6～0.596 3(見(jiàn)表3)，廣西臨桂種群和貴州都勻種群相似性最高(0.596 3)，福建寧化種群和廣東英德種群其次(0.595 7)，江西永修種群和廣西臨桂種群最低(0.515 6)，這與Nei’s遺傳距離是一致的。

表3 蕭氏松莖象不同地理種群間遺傳距離指數(shù)和遺傳相似系數(shù)?Table 3 Genetic distance and genetic identities between populations

根據(jù)遺傳距離的大小，應(yīng)用UPGMA建樹(shù)方法對(duì)蕭氏松莖象7個(gè)種群以及所有個(gè)體進(jìn)行聚類(lèi)分析，種群間聚類(lèi)圖(圖2)與個(gè)體間聚類(lèi)圖(圖3)相符。由圖2、3可知，個(gè)體間均以地理種群進(jìn)行類(lèi)聚， 7個(gè)地理種群在相似性系數(shù)為0.570 0時(shí)分成4支，福建寧化種群、廣東英德種群和湖北荊門(mén)種群為一支，廣西臨桂種群和貴州都勻種群為一支，湖南東安種群和江西永修種群分別為單獨(dú)的一支。

圖2 蕭氏松莖象7個(gè)地理種群間的UPGMA聚類(lèi)Fig. 2 UPGMA dendrogram of 7 populations of H.xiaoi

圖3 蕭氏松莖象35個(gè)個(gè)體的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)Fig. 3 UPGMA dendrogram of 35 individuals of H.xiaoi

2.4 蕭氏松莖象的遺傳多樣性

由Shannon’s信息指數(shù)(表4)顯示，7個(gè)地理種群的平均多樣性在0.588 6到0.625 7之間變化，平均遺傳多樣性由高到低的順序?yàn)?江西永修種群為0.588 6、湖南東安種群為0.590 1、湖北荊門(mén)種群為0.594 3、福建寧化種群為0.595 3、貴州都勻種群為0.598 9、廣西臨桂種群為0.604 4、廣東英德種群為0.625 7。

用POPGENE軟件在假設(shè)遺傳平衡時(shí)，由Shannon’s信息指數(shù)估算的種群間遺傳分化數(shù)據(jù)(見(jiàn)表5)顯示，總體遺傳多樣性(Ht)為0.420 4，種群平均遺傳多樣性(Hs)為0.411 9，種群內(nèi)平均遺傳多樣性(Hs)占總體遺傳多樣性(Ht)的97.98%。根據(jù)總體遺傳多樣性和種群平均遺傳多樣性計(jì)算不同種群間的遺傳分化水平，基因分化系數(shù)(Gst)為0.020 2，即表明總的遺傳變異中只有2.02%的變異存在在種群間。種群每代遷移數(shù)是測(cè)定基因流的一種方法，用于反映各種群間及種群內(nèi)的遺傳分化程度。估算得出基因流(Nm)的平均值為24.313 1，可以認(rèn)為種群間的基因流很大。

Nei’s遺傳距離數(shù)據(jù)(表6)顯示，蕭氏松莖象7個(gè)地理種群的遺傳距離差異較小，在0.009 0到0.030 2之間，均小于0.05。其中廣西臨桂種群和江西永修種群之間的遺傳距離最大(0.030 2)，廣西臨桂種群和貴州都勻種群之間的遺傳距離最小(0.009 0)，種群遺傳距離與種群地理距離之間無(wú)明顯相關(guān)性。

表4 各地理種群各引物的Shannon’s信息指數(shù)Table 4 Shannon’s index of various primers of geographic populations

表5 由Shannon’s信息指數(shù)估算的種群間遺傳分化?Table 5 Genetic differentiation among populations estimated by Shannon’s index

表6 蕭氏松莖象不同地理種群間Nei’s遺傳距離Table 6 Nei’s genetic distance of 7 populations of H.xiaoi

3 討 論

RAPD技術(shù)在許多昆蟲(chóng)種類(lèi)的研究中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但在蕭氏松莖象種群的研究中未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)篩選出適合的PСR反應(yīng)體系，使用39條引物，檢測(cè)出489條多態(tài)性條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出12.5條多態(tài)性條帶且具有較好的重復(fù)性，其多態(tài)性豐富，對(duì)蕭氏松莖象種群遺傳差異的檢測(cè)效率非常高。

蕭氏松莖象是非遷飛性害蟲(chóng)，成蟲(chóng)飛翔能力較弱。本試驗(yàn)結(jié)果表明，蕭氏松莖象不同地理種群之間已經(jīng)產(chǎn)生了一定程度的遺傳分化。從系統(tǒng)聚類(lèi)圖來(lái)看，這種分化或許是和地理位置有一定關(guān)系的。在相似性系數(shù)為0.570 0時(shí)，蕭氏松莖象7個(gè)地理種群被分成4個(gè)主要的聚類(lèi)簇。廣西臨桂種群和貴州都勻種群親緣關(guān)系最近，福建寧化種群和廣東英德種群其次，廣西臨桂種群和江西永修種群親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。從地理位置來(lái)看，江西永修種群較其他種群遺傳距離遠(yuǎn)，這可能是由于它的地理隔絕較早故差異較大，此結(jié)果也符合蕭氏松莖象最早發(fā)生在江西省境內(nèi)的說(shuō)法[2-3]。然后，它們傳播到附近各省形成不同的聚類(lèi)簇。而福建寧化種群和廣東英德種群，廣西臨桂種群和貴州都勻種群，它們間的地理位置均相互靠近為鄰省，在地理位置上極有利于蕭氏松莖象的傳播。

由Shannon’s信息指數(shù)顯示:廣東英德種群和廣西臨桂種群的種群遺傳多樣性相對(duì)較高；江西永修種群和湖南東安種群遺傳多樣性相對(duì)較低。其結(jié)果與Dice相似系數(shù)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。

基于Shannon’s信息指數(shù)估算的種群間遺傳分化顯示，蕭氏松莖象種群內(nèi)的遺傳變異比率(97.98%)遠(yuǎn)高于其種群間的遺傳變異比率(2.02%)；根據(jù)種群間遺傳分化系數(shù)(Gst)計(jì)算種群每代遷移數(shù)目(Nm)為24.313 1，可防止由遺傳漂變引起的蕭氏松莖象種群間的遺傳分化；Nei’s遺傳距離揭示種群間的遺傳距離較小(均小于0.05)。這幾項(xiàng)數(shù)據(jù)結(jié)果綜合表明，蕭氏松莖象7個(gè)地理種群之間有一定的遺傳分化，但種群間遺傳關(guān)系很近，種群之間保持著一定水平的基因交流，這可能與樹(shù)苗和木材的跨省運(yùn)輸有關(guān)。

綜上所述，蕭氏松莖象7個(gè)地理種群間保持著一定程度的基因交流，種群內(nèi)具有較高的遺傳多樣性，種群間遺傳距離較小。由于地理位置的差異，各種群間有不同程度的遺傳分化，可初步判定其傳播路徑。

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RAPD analysis on genetic diversity of Hylobitelus xiaoi Zhang from different geographical population in China

L? Guo-hong ,WANG Wei ,ZHAO Tong-hai
(Research ?nstitute of Forest Ecology, Environment and Protection, Сhinese Academy of Forestry, Beijing 100091, Сhina)

The genetic variation of seven geographic populations ofH. xiaoiwere detected by RAPD. A total of 489 bands(from 250 bp to 2 000 bp) were amplif i ed by using 39 primers screened from 80 random primers of which 443 bands (90.6%) were polymorphic,thus the average number of polymorphic bands was 11.4 per primer. The data analysis show that the genetic comparability of the seven geographic populations varied from 0.515 6 to 0.596 3 and the range of genetic distance was from 0.403 7 to 0.484 4, with the average 0.444 1. The Shannon’s information index was from 0.588 6 to 0.625 7 and the Nei’s genetic distance was from 0.009 0 to 0.030 2.The seven geographical populations were classif i ed into four cluster groups by UPGMA method. The studying results revealed that the genetic diversity and homology existed between geographic populations ofH. xiaoi.

Hylobitelus xiaoiZhang; geographic population; genetic diversity; RAPD

S718.7

A

1673-923X (2012)05-0149-06

2011-09-22

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(СAFR?FEEP201007)

李國(guó)宏(1971-)，男，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事林木蛀干害蟲(chóng)研究；E-mail:lmz9827@yahoo.com.cn

[本文編校：吳 毅]