王朝元，唐俊龍，魏甜甜，宋 超，楊光忠

(1 中南民族大學 生命科學學院， 武漢 430074；2 中南民族大學 藥學院， 武漢 470074)

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

山芝烯二醇由中南民族大學藥學院提供.DMEM/High Glucose(Thermo)，小牛血清(四季青)，胰蛋白酶、二甲基亞砜(Amresco)，MTT(Amerro)，ALP試劑盒(南京建成生物科技公司)，Trizol(Invitrogen)，PCR引物(武漢博越技術有限公司)，反轉錄試劑盒(Fermentas)，SYBR Green熒光染料(TOYOBO),昆明種小鼠(湖北省疾病控制中心).

CO2培養(yǎng)箱(HF90/240型，利康生物醫(yī)療科技控股集團)，倒置顯微鏡(Motic AE21型，重慶光學儀器)，酶聯(lián)免疫檢測儀(MULTISKAN ASCENT 354 型，THERMO)，可見分光光度計(721型，上海光學儀器)，普通PCR儀(Biometra，德國)，凝膠成像分析儀 (JS-380A，上海培清科技)，熒光定量PCR儀(Rotor-gene 2000，Corbett research 澳大利亞).

1.2 山芝烯二醇的分離純化及其貯存液的制備

從玉柏石松中分離純化山芝烯二醇[5]，稱取山芝烯二醇粉末，用二甲基亞砜溶解，使其終濃度為1.6×10-3mol/L，用0.22 μm濾膜過濾除菌.于4℃冰箱保存.

1.3 原代小鼠顱骨成骨細胞培養(yǎng)

分離出生3d的昆明小鼠的顱骨，剪碎后用0.1%的胰蛋白酶消化40 min，加入5mL含有10%新生小牛血清的DMEM，1500 r/min，5 min離心棄上清，將沉淀轉入到培養(yǎng)瓶中加入DMEM，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.4 山芝烯二醇對成骨細胞增殖率的影響

取第二代成骨細胞，按1.0×104細胞/孔接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h.待細胞貼壁后更換培養(yǎng)基，加入終濃度分別為1，2，4，8μmol/L的山芝烯二醇.設不加藥為對照組，每組5個復孔.分別在加藥后培養(yǎng)0 d(細胞接板2h貼壁)，1d，3d，每孔加入20μL MTT，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中反應4h.小心吸出上清，每孔加入150μL DMSO，用移液器反復吹打并置37℃培養(yǎng)箱中10 min充分溶解紫色結晶.用酶標儀測定OD492.

1.5 山芝烯二醇對成骨細胞ALP活性的影響

取原代培養(yǎng)成骨細胞，按2.0×104細胞/孔接種于24孔板中.置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h.待細胞貼壁后換成誘導培養(yǎng)基(普通培養(yǎng)基中加入終濃度為50μg/mL維生素C、10mMβ-甘油磷酸鈉、10-8mol/L地塞米松)培養(yǎng)，分別加入加入終濃度為1，2，4，8μmol/L的山芝烯二醇.設不加藥為對照組，每組3個復孔.培養(yǎng)3，6，9 d后，每孔加100μL 0.1% Triton X-100裂解過夜，用ALP試劑盒測定ALP活性.

1.6 山芝烯二醇對成骨細胞早期分化相關基因表達的影響

取原代培養(yǎng)成骨細胞，按1×105細胞/孔接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h.細胞貼壁后換誘導培養(yǎng)基培養(yǎng).加入終濃度為2，4μmol/L的山芝烯二醇.如1.5設復孔和對照.培養(yǎng)3,6,9 d后，用Trizol法提取細胞總RNA，通過反轉錄試劑盒合成cDNA，以此為模板進行熒光定量PCR.每個樣品重復3次，通過2-ΔΔCt法[6]計算藥物對相關基因c-jun、c-fos、Osterix、Col-Ⅰ、ALP、OC(引物見表1)表達的影響.

表1 骨相關基因定量PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計分析

根據(jù)公式F=2﹣[(待測組目的基因平均Ct值-待測組內參基因平均Ct值)-(對照組目的基因平均Ct值-對照組內參基因平均Ct值)],計算出目的基因的相對表達量.用單因素方差分析(one-way ANOVA)對結果進行顯著性差異分析.

響應面法優(yōu)化山藥飲片多糖的提取條件……………………………………………………… 李 靜，操慶國，韓艷麗，凡軍民（118）

2 結果與分析

2.1 山芝烯二醇對成骨細胞增殖率的影響

山芝烯二醇對成骨細胞增殖的影響見圖1.由圖1可見，藥物處理1 d時，1 μmol/L的山芝烯二醇無明顯的促進作用(P>0.05)，而其他各濃度均對成骨細胞的增殖有明顯的促進作用(P<0.05).3d時，各濃度藥物均顯著促進成骨細胞的增殖(P<0.01).

1) control； 2-5)依次為1，2，4，8μmol/L山芝烯二醇與對照組比較，* P<0.05，**P<0.01，n=5

2.2 山芝烯二醇對成骨細胞ALP活性的影響

山芝烯二醇對成骨細胞ALP活性的影響見圖2.由圖2可見，藥物處理3 d時，8 μmol/L藥物抑制成骨細胞ALP活性(P<0.01)，其他濃度無顯著影響(P>0.05).6 d時， 1 μmol/L藥物抑制成骨細胞ALP活性(P<0.05)，其他濃度無顯著影響(P>0.05).9 d時，高濃度(2，4，8μmol/L)的藥物均顯著促進成骨細胞ALP活性(P<0.05)，低濃度(1μmoL)則對其無顯著影響(P>0.05).

1) control； 2-5)依次為1，2，4，8μmol/L山芝烯二醇與對照組比較，* P< 0.05，**P<0.01，n=3

由2.1和2.2可知， 2,4 μmol/L的山芝烯二醇最能促進成骨細胞的增殖和堿性磷酸酶活性，故選此2個濃度進一步研究其對成骨細胞成骨活性相關基因表達的影響.

2.3 山芝烯二醇對骨相關基因表達的影響

山芝烯二醇對c-jun基因表達影響見圖3.由圖3可見，藥物處理3 d時，2 μmol/L的山芝烯二醇促進c-jun基因表達(P<0.05)，4 μmol/L的山芝烯二醇對c-jun無顯著影響(P>0.05).6 d和9 d時，2種濃度的山芝烯二醇對c-jun均無顯著影響(P>0.05).

1) control； 2-3)依次為2，4μmol/L山芝烯二醇與對照組比較，* P< 0.05，**P<0.01，n=3

山芝烯二醇對c-fos基因表達影響見圖4.由圖4可見，藥物處理3 d時，2 ，4 μmol/L的山芝烯二醇均促進c-fos表達(P<0.05).6 d和9 d時，2種濃度的山芝烯二醇對成骨細胞的c-fos均無顯著影響(P>0.05).

1) control； 2-3)依次為2，4μmol/L山芝烯二醇與對照組比較，* P< 0.05，**P<0.01，n=3

山芝烯二醇對Osterix基因表達影響見圖5.由圖5可見，藥物處理3 d時， 4 μmol/L藥物抑制Osterix表達(P<0.05)，2 μmol/L藥物對Osterix無顯著影響(P>0.05).6 d和9 d時，2個濃度藥物均促進Osterix表達(P<0.05).

1) control； 2-3)依次為2，4μmol/L 山芝烯二醇與對照組比較，* P< 0.05，**P<0.01，n=3

山芝烯二醇對ALP基因表達影響見圖6.由圖6可見，藥物處理3 d和6 d時，2種濃度藥物對ALP均無顯著影響(P>0.05).9 d時，2種濃度藥物促進ALP表達(P<0.05).

1) control； 2-3)依次為2，4μmol/L 山芝烯二醇與對照組比較，* P< 0.05，**P<0.01，n=3

山芝烯二醇對Col-Ⅰ基因表達影響見圖7.由圖7可見，藥物處理3 d和6 d時，2 μmol/L藥物促進Col-Ⅰ表達(P<0.05)，4 μmol/L藥物對其表達無顯著影響(P>0.05).9 d時，2種濃度藥物均促進Col-Ⅰ基因表達(P<0.05).

1) control； 2-3)依次為2，4μmol/L山芝烯二醇與對照組比較，* P< 0.05，**P<0.01，n=3

山芝烯二醇對OC基因表達影響見圖8.由圖8可見，藥物處理3 d和6 d時，各個濃度無顯著影響(P>0.05).9 d時，2μmol/L藥物抑制OC基因表達(P<0.05)，4μmol/L藥物對OC表達無顯著影響(P>0.05).

1) control； 2-3)依次為2，4μmol/L山芝烯二醇與對照組比較，* P< 0.05，**P<0.01，n=3

3 討論

成骨細胞在骨形成過程中經(jīng)歷分裂增殖、分化和基質鈣化3個階段[7].本實驗以體外培養(yǎng)成骨細胞為模型，研究玉柏石松提取物山芝烯二醇對成骨細胞增殖和分化的影響.

實驗中山芝烯二醇短期處理(1 d和3 d)可促進成骨細胞增殖，短期處理(3 d和6 d)ALP活性影響不大，但長期處理(9 d)時，2，8 μmol/L的山芝烯二醇均顯著促進ALP活性.由于ALP是成骨細胞分化的早期標志[8]，說明山芝烯二醇不僅可以促進成骨細胞的增殖，還可以促進成骨細胞的分化.

在成骨細胞的分裂增殖過程中一些基因的表達具有十分重要的意義.其中c-jun、c-fos是原癌基因，它編碼的蛋白是構成轉錄激活因子AP-1的重要組成部分，而AP-1轉錄因子是重要的基因表達調節(jié)因子，與細胞的增殖和轉化密切相關[9-11].細胞從顱蓋骨中分離后很快出現(xiàn)最高水平c-fos基因表達，而c-jun、c-fos基因表達在增殖晚期明顯下調，同時伴隨成骨細胞增殖減慢，細胞由增殖期進入分化期[12].實驗中2 μmol/L和4 μmol/L的山芝烯二醇對c-jun、c-fos基因表達的影響趨勢相同：早期處理(3 d)促進其表達，長期處理(6～9 d)無明顯作用，與MTT結果一致.

Osterix基因是Nakashima[13]等發(fā)現(xiàn)的僅在發(fā)育的骨組織中特異性表達的轉錄因子，是早期成骨細胞分化和骨形成過程中必需的轉錄因子.實驗中山芝烯二醇長期處理(6～9 d)可以顯著促進Osterix表達，9 d效果更顯著.說明山芝烯二醇處理后，成骨細胞內c-jun、c-fos等轉錄因子首先被激活，Osterix等骨特異分化因子隨之被激活，促進成骨細胞分化成熟.

骨基質是由成骨細胞分泌的蛋白質所形成的，其中堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)、骨鈣素(OC)等蛋白質對基質的成熟和礦化起到了重要作用.實驗中山芝烯二醇長期處理(9 d)促進ALP基因表達，短期處理(3～6 d)則無明顯作用，與ALP活性實驗結果相符.Col-Ⅰ是骨中的有機基質模板，是骨基質的主要有機成分[14].2 μmol/L的山芝烯二醇在3～9 d內均促進Col-Ⅰ基因表達，而4 μmol/L的山芝烯二醇在9 d時才有促進作用.與Col-Ⅰ不同，2 μmol/L 山芝烯二醇處理9 d對OC基因的表達無顯著促進作用，反而有一定抑制作用.具體機理尚待進一步研究.

綜上所述,山芝烯二醇早期促進成骨細胞增殖、晚期促進ALP活性，并能影響成骨關鍵基因的表達和促進成骨細胞的早期分化.其機制是首先通過促進成骨細胞內c-jun、c-fos等轉錄因子的表達，激活Osterix基因，進而促進ALP和Col-I等基因的表達，促進成骨細胞分化成熟.因此，山芝烯二醇具有成骨活性，是玉柏石松促進成骨的有效成分之一.

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