李海波，李英華，王 洪，王 鑫，鄒 軼，孫鐵珩

（沈陽大學(xué) 區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110044）

聚乙烯醇－海藻酸鈉固定Flavobacteriumsp.對地表水的修復(fù)效果

李海波，李英華，王 洪，王 鑫，鄒 軼，孫鐵珩

（沈陽大學(xué) 區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110044）

從河流底泥、河水水體中分離得到一株黃桿菌Flavobacteriumsp.（Oil 56）.用聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）和海藻酸鈉（sodium alginates，Na·Alg）為包埋載體，以五硼酸銨和氯酸鐵溶液為交聯(lián)劑，固定黃桿菌Flavobacteriumsp.Oil 56得到固定化球形顆粒.對比研究了固定化顆粒與游離菌對地表水的降解效果，結(jié)果表明在COD初始質(zhì)量濃度為77～205 mg／L時(shí)，用固定化Flavobacteriumsp.Oil 56修復(fù)48 h的COD去除率為48.2%～50.6%，比游離菌的降解效率提高了42.7%～45.8%.利用掃描電鏡（SEM）研究了固定化球形顆粒在降解過程中的微環(huán)境變化.

固定化微生物；地表水；黃桿菌；微環(huán)境

地表水質(zhì)的快速不可逆性惡化源于工農(nóng)業(yè)的高速發(fā)展.而受污染地表水的特殊性質(zhì)增加了傳統(tǒng)修復(fù)技術(shù)實(shí)施的難度，探索新型高效的修復(fù)技術(shù)迫在眉睫［1］.

微生物固定化技術(shù)的核心是：在可調(diào)控環(huán)境條件下，通過生物降解和生物轉(zhuǎn)化，可原位消減污染，費(fèi)用低廉、簡單高效、不產(chǎn)生內(nèi)源污染.鑒于生物水處理科學(xué)內(nèi)涵的一致性，將固定化微生物技術(shù)引入地表水修復(fù)領(lǐng)域在理論上是可行的，實(shí)踐上也先后出現(xiàn)了一些成功的工程事例［2－3］.微生物固定化技術(shù)作為新興的污水生物處理方法，已經(jīng)在生活污水和行業(yè)廢水治理中得到較為成熟的應(yīng)用，但用于修復(fù)污染地表水體則鮮見文獻(xiàn)報(bào)道［4－5］.因此，本研究以 COD 為主要污染指標(biāo)，采用聚乙烯醇 －海藻酸鈉包埋方法固定Flavobacteriumsp.技術(shù)，形成Flavobacteriumsp.固定化球形顆粒，對比了固定化顆粒與游離菌對地表水中COD的降解效果.同時(shí)，采用SEM技術(shù)，獲得固定化顆粒的微觀結(jié)構(gòu)解析，初步闡明固定化微環(huán)境屏蔽機(jī)理.

1 材料與方法

1.1 地表水水質(zhì)

受污染地表水采自沈陽市青年公園湖.采用國標(biāo)方法［6］，分析了樣品中的p H、COD、SS、NH3－N、TP和DO，結(jié)果如表1所示.

表1 地表水主要水質(zhì)指標(biāo)Table 1 Main qualityindexes of the surface water

主要污染指標(biāo)COD的值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB 3838—2002）Ⅴ類標(biāo)準(zhǔn)，DO指標(biāo)低于Ⅳ類標(biāo)準(zhǔn).

1.2 供試菌株

實(shí)驗(yàn)用菌株分離篩選自沈陽城市運(yùn)河河水、運(yùn)河底泥以及EM（北京）菌液，部分為中科院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所污染生態(tài)組保存菌種.經(jīng)篩選馴化實(shí)驗(yàn)，獲得一株對COD具有高效降解去除能力的細(xì)菌，其實(shí)驗(yàn)室命名分別為：Oil 56.而后用平板劃線分離法進(jìn)行純化.純化得到的菌株（包括實(shí)驗(yàn)室保存菌株）再通過解酯酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，目的在于篩選出對脂肪烴類等城市地表水中含量較高的污染物存在較強(qiáng)降解能力的菌株.由于地表水COD值較低，屬于微C營養(yǎng)水體，所以在對菌株進(jìn)行了COD降解能力測試后，對菌株進(jìn)行了低C營養(yǎng)馴化實(shí)驗(yàn)（圖1）.

圖1 Oil 56低C營養(yǎng)馴化結(jié)果Fig.1 Results of Oil 56 domestication under low C nutrition

低C營養(yǎng)馴化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，篩選出的菌經(jīng)過馴化實(shí)驗(yàn)，能夠在低C營養(yǎng)條件下，良好生存生長，適應(yīng)地表水微C營養(yǎng)特性.

在蛋白胨基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基上呈黃色，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈細(xì)長桿狀，周生鞭毛，不形成芽孢，革蘭氏染色呈陰性.其細(xì)菌形態(tài)如圖2所示，生長曲線如圖3所示.

圖2 Oil 56顯微照片F(xiàn)ig.2 Micrograph for Oil 56

經(jīng)菌株初步鑒定結(jié)果，Oil 56為黃桿菌屬Flavobacteriumsp.Oil 56.

1.3 分析方法

采用重鉻酸鉀法測定水體COD值.需要指出的是：由于COD值較小時(shí)，該方法的靈敏度受到限制，因此每次修復(fù)試驗(yàn)后期的測試值，僅可以反映出COD變化規(guī)律，不足以成為真實(shí)的修復(fù)終點(diǎn)值.

圖3 Oil 56生長曲線Fig.3 Growth curve for Oil 56

采用掃描電子顯微鏡分析固定化產(chǎn)品的微觀結(jié)構(gòu)和對比固定化細(xì)菌與游離菌形態(tài)差異.一般進(jìn)行細(xì)菌SEM制樣時(shí)均采用戊二醛固定（蛋白凝結(jié)）的方法.本研究發(fā)現(xiàn)，對于Oil 56細(xì)菌，戊二醛濃度過高將造成細(xì)菌溶解.因此，本研究實(shí)驗(yàn)了透射電鏡制樣固定劑鋨酸＋戊二醛的聯(lián)合固定技術(shù)，采用5份體積的低濃度戊二醛預(yù)先固定，然后采用1份體積的鋨酸二次固定，兩次操作時(shí)間間隔1.5 h.采用CO2臨界點(diǎn)干燥技術(shù)對樣品進(jìn)行干燥，等離子高速噴金.分別切制顆粒不同位置制片，觀察.采用平板計(jì)數(shù)方法測定細(xì)菌數(shù)量.

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化微生物與游離菌的修復(fù)效果對比

地表水COD初始質(zhì)量濃度為77～205 mg／L條件下，對比研究Flavobacteriumsp.Oil 56固定化球形顆粒與游離菌的修復(fù)效果隨修復(fù)時(shí)間的變化趨勢，結(jié)果如圖4所示.

圖4 不同初始質(zhì)量濃度下固定化及游離菌對COD的降解效果Fig.4 Degradation effects of COD under different initial concentrations for immobilized and free cells

城市靜止或緩流污染水體自我稀釋凈化能力差，污染源多，影響范圍廣，對其修復(fù)最好在短時(shí)間內(nèi)獲得效果，才能夠最大限度地避免污染水體對城市環(huán)境（旅游、休閑，城市地下水）的破壞［7］.利用固定化細(xì)菌修復(fù)城市靜止或緩流污染地表水，尤其是景觀水體，具有較好的應(yīng)用前景［8］.實(shí)驗(yàn)室模擬修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：固定化Flavobacteriumsp.球形顆粒產(chǎn)品對不同初始COD質(zhì)量濃度的地表水體均能發(fā)揮較好的修復(fù)效果，與游離菌相比，在COD初始濃度為77～205 mg／L時(shí)，固定化Flavobacterium sp.Oil 56修復(fù)48 h的COD去除率為48.2%～50.6%，比游離菌的降解效率提高了42.7%～45.8%.尤其對于COD質(zhì)量濃度較低的水體，固定化菌劑表現(xiàn)出良好的微C營養(yǎng)適應(yīng)性，經(jīng)72 h修復(fù)，水體殘留COD質(zhì)量濃度最低可達(dá)10 mg／L以下.與污水生化處理技術(shù)相比，72 h仍是一個(gè)較長的時(shí)間，對于流動水體，如何保證充足的水力停留時(shí)間，將是一個(gè)急需解決的課題.

為了獲得最適宜進(jìn)行細(xì)菌固定化修復(fù)的初始COD質(zhì)量濃度，對固定化顆粒修復(fù)72 h的水體殘留COD進(jìn)行了比對，結(jié)果表明：初始COD質(zhì)量濃度高水樣COD殘留值也高，這意味著如果規(guī)定同一修復(fù)終點(diǎn)，則后者需要更長的運(yùn)行周期.初始COD質(zhì)量濃度為77 mg／L和110 mg／L時(shí)，修復(fù)72 h達(dá)到的效果相似，后者水樣殘留COD略高，但和前者很接近.這說明本研究篩選得到的細(xì)菌更適宜低C營養(yǎng)地表水體修復(fù)，但對高C營養(yǎng)地表水體，也可以發(fā)揮較好效果，即對于以COD為主要污染指標(biāo)的輕污染和重污染地表水體，都可發(fā)揮高效修復(fù)作用.

2.2 固定化微生物微觀結(jié)構(gòu)

細(xì)菌在固定化顆粒內(nèi)部的生存空間是相對封閉和穩(wěn)定的微環(huán)境，這種特定的微環(huán)境既可以保證細(xì)菌正常的生理代謝過程，又可以保護(hù)細(xì)菌不受外界不利因素的侵害，如抵御土著細(xì)菌的競爭，防止噬菌體和毒性物質(zhì)的吞噬和毒害，等等［9－10］.因此，良好的微環(huán)境有助于強(qiáng)化細(xì)菌對地表水中有機(jī)污染物的高效利用或降解，進(jìn)而強(qiáng)化修復(fù)過程［11］.但不論固定化技術(shù)如何進(jìn)步，被束縛的空間和自由的空間相比，傳質(zhì)滲透性總會發(fā)生改變，而這些改變幾乎都向著不利于細(xì)菌生長的方向發(fā)展；同時(shí)，固定化過程也是生物體的受害過程，化學(xué)反應(yīng)放熱和物理冷凍的活性抑制，都可以導(dǎo)致細(xì)菌生理活性發(fā)生重大改變，甚至導(dǎo)致固定化失?。?2－13］.因此，在研究微環(huán)境機(jī)制的同時(shí)，有必要了解細(xì)菌形態(tài)的變化，因?yàn)榧?xì)菌形態(tài)的變化有時(shí)候是微環(huán)境作用的結(jié)果，這兩個(gè)方面很難截然分開.對比研究了固定化前后細(xì)菌形態(tài)的變化情況，結(jié)果如圖5所示.

圖5 固定化及游離菌的SEM照片F(xiàn)ig.5 SEM photos for immobilized and free cells

圖5a是固定化前Oil 56的自由狀態(tài).在固定化顆粒中心區(qū)位置附近（圖5b），Oil 56形態(tài)發(fā)生了明顯改變：固定化態(tài)的Oil 56菌體大小不一，表面有較多的沉積物（deposit），凹凸不平，存在大量呈萎縮狀態(tài)的短桿，甚至存在發(fā)生異常斷裂的類桿狀菌體，有些形狀極不規(guī)則，大量菌體集中在一起形成不規(guī)則菌落，菌落周圍空間狹窄；從照片左下角可見菌體被載體材料包埋情況.盡管PVA載體網(wǎng)絡(luò)孔隙發(fā)達(dá)，但過于緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)限制了細(xì)菌自由生長，導(dǎo)致菌體形態(tài)發(fā)生明顯改變；菌體長短不一的現(xiàn)象說明：沒有受到載體網(wǎng)絡(luò)束縛的細(xì)菌可以分裂繁殖，受到束縛的菌體則失去了自由繁殖的足夠空間；此外，耗氧培養(yǎng)過程中，顆粒外層更容易獲得足夠的氧氣，而越靠近顆粒中心，細(xì)菌獲得氧氣的概率就越小，營養(yǎng)底物向內(nèi)傳質(zhì)的能力被抑制，代謝產(chǎn)物向外擴(kuò)散傳質(zhì)能力也受到限制，這也是菌體變形的誘因之一.在剖面1（圖5c）位置出現(xiàn)較大空洞，這是因?yàn)镹a·Alg產(chǎn)生了溶解現(xiàn)象而造成的.Oil 56在大的“溶洞”里可以自由生長，菌體大小基本一致，但表面仍包裹有較多的沉積物質(zhì)，一些菌體局部產(chǎn)生凹陷和膨脹現(xiàn)象，這是因?yàn)楣潭ɑw粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)不均勻，考慮到傳質(zhì)過程的連續(xù)性和傳質(zhì)阻力的串聯(lián)性，與該位置相聯(lián)系的其他部位傳質(zhì)性差，將導(dǎo)致整個(gè)傳質(zhì)過程在路線上喪失連貫，代謝產(chǎn)物不能迅速擴(kuò)散到顆粒外，造成在菌體表面沉積積累，在一定程度上限制了菌體的自由生長，也會誘發(fā)菌體形態(tài)改變.細(xì)菌在大溶洞中優(yōu)先生長，隨著細(xì)菌濃度增加，進(jìn)一步壓迫溶洞壁，對周圍的微小孔隙將產(chǎn)生額外壓力，導(dǎo)致這些孔隙縮小甚至成為盲孔，細(xì)菌的不均勻生長將最終導(dǎo)致局部受力不均勻，顆粒破碎.

越靠近固定化顆粒表面，傳質(zhì)擴(kuò)散性能越優(yōu)，細(xì)菌獲得氧氣、底物的機(jī)會就越大，排泄和釋放產(chǎn)物的空間越不受限制（圖5d）.Oil 56在固定化顆粒表層生長良好，菌體分散均勻，個(gè)體形態(tài)一致，處于裂殖期；顆粒孔隙發(fā)達(dá)，孔隙內(nèi)壁光滑，對菌體的限制作用以孔隙包埋為主，即，菌體在孔隙內(nèi)的吸附，幾乎未見載體包埋現(xiàn)象.因此，細(xì)菌生長不受載體包埋束縛的限制.但Oil 56表面仍存在一定量的沉積物，沉積物對菌體的包裹使得細(xì)菌無法像在液體培養(yǎng)時(shí)那樣自由生長，菌體的形態(tài)依然發(fā)生了同中心區(qū)以及中間區(qū)類似的改變.這表明：固定化造成的傳質(zhì)擴(kuò)散能力下降是一個(gè)不能完全消除的矛盾.

3 結(jié) 論

（1）對城市地表水污染特點(diǎn)，從河流底泥、河水水體以及EM菌液中分離得到一株對COD具有較高去除能力的細(xì)菌：Flavobacteriumsp.Oil 56.

（2）用聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）和海藻酸鈉（sodium alginates，Na·Alg）為包埋載體，以五硼酸銨和氯酸鐵溶液為交聯(lián)劑，固定Flavobacteriumsp.Oil 56得到球形顆粒.

（3）固定化Flavobacteriumsp.Oil 56對不同COD初始質(zhì)量濃度的地表水均具有較好的修復(fù)效果.COD初始質(zhì)量濃度為77.4 mg／L的城市地表水，經(jīng)72 h修復(fù)，水體殘留COD值最低可達(dá)到10 mg／L以下.COD初始濃度為77～205 g／L時(shí)，用固定化Flavobacterium sp.Oil 56修復(fù)48h的COD去除率為48.2%～50.6%，比游離菌的降解效率提高了42.7%～45.8%.

（4）利用SEM分析了固定化球形顆粒的微觀結(jié)構(gòu)和細(xì)菌在顆粒內(nèi)部的形態(tài)變化，結(jié)果表明雖然顆粒內(nèi)部豐富的孔隙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為細(xì)菌提供了良好的生存空間，但PVA－Na?Alg包埋體系尚存在一些需要改進(jìn)的結(jié)構(gòu)缺陷.

［1］ Adeyemi A O，Gadd G M.Fungal degradation of calciumlead and silicon－bearing minerals［J］.Biometals，2005，18：269－281.

［2］ Baeza A，Guillen J.Influence of the soil bioavailability of radionuclides on the transfer of uranium and thorium to mushrooms［J］.Applied Radiation and Isotopes，2006，64：1020－1026.

［3］ 沈德中.污染環(huán)境的生物修復(fù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：22－30.

［4］ Borovicka J，Randa Z，Jelinek E.Antimony content of macrofungi from clean and polluted areas ［J］.Chemosphere，2006，64：1837－1844.

［5］ Bronick C J，Lal R.Soil structure and management：A review［J］.Geoderma，2005，124：3－22.

［6］ American Public Health Association（APHA）American Public Health Association／American Water Works Association／Water Environment Federation，Washington.Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater［R］.DC，USA.2003：41－75.

［7］ 陳玉成.污染環(huán)境生物修復(fù)工程［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：10－12.

［8］ Brown S，Chaney R，Hallfrisch J，et al.In situ soil treatment to reduce the phyto－and bioavailability of lead，zinc，and cadmium［J］.Journal of Environmental Quality，2004，33：522－531.

［9］ Fomina M，Charnock J，Bowen A D，et al.X－ray absorption spectroscopy （XAS）of toxic metal mineral transformations by fungi ［J］. Environmental Microbiology，2007，9：308－321.

［10］ 曲久輝.我國水體復(fù)合污染與控制［J］.環(huán)境對社會的影響，2000，1：36－40.

［11］ Sayler G S.Environmental biotechnology for water treatment［M］.NY：Plenum Press，1992：5－10.

［12］ 田偉軍，王超，李勇，等.城市污染水體強(qiáng)化凈化技術(shù)研究進(jìn)展［J］.河海大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，32（2）：136－139.

［13］ 湯建中，宋韜，江心英.城市河流污染治理的國際經(jīng)驗(yàn)［J］.世界地理研究，1998，7（2）：114－119.

Treatment efficiency of polyvinyl alcohol and sodium alginate immobilizedFlavobacteriumsp.

LIHaibo，LIYinghua，WANGHong，WANGXin，ZOUYi，SUNTieheng
（Key Laboratory of Regional Environment and Eco－Remediation （Ministry of Education），Shenyang University，Shenyang 110044，China）

One strain was isolated from hydrocarbon－polluted surface water and sludge and was representative ofFlavobacteriumsp.（strain Oil－56）.Polyvinyl alcohol（PVA）and sodium alginates（Na·Alg）embedding technology were adopted forFlavobacteriumsp.immobilization.Secondly，the study investigated the treatment efficiency of the immobilizedFlavobacteriumsp.The immobilizedFlavobacteriumsp.beads made in this study were suitable for remediation of COD－contaminated surface water with a wide range of initial COD values.At initial COD 77～205 mg／L，the residual COD values for immobilized cells were 38～98 mg／L after 48 h，with removal efficiencies of 48.2%～50.6%，which was 42.7%～45.8%higher than the free cells.The Scanning Electronic Microscope（SEM）analysis indicated that the bead microstructure was suitable for growth of Flavobacterium sp.

immobilized cell；surface water；Flavobacteriumsp.；micro－environment

X 703.1

A

1008－9225（2012）02－0001－05

2011－11－30

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（50908151，51108275）；遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20082195）；遼寧省高校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃資助項(xiàng)目（LR201028）.

李海波（1974－），男，河北承德人，沈陽大學(xué)教授，博士；孫鐵珩（1938－），男，遼寧海城人，沈陽大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，中國工程院院士.

王 穎】