陳祥娥，凌沛學(xué)

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東省生物藥物研究院 博士后科研工作站，山東 濟(jì)南250101)

肝素微生物生產(chǎn)展望

陳祥娥1，2，凌沛學(xué)1，2

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東省生物藥物研究院 博士后科研工作站，山東 濟(jì)南250101)

肝素作為重要的抗凝血藥物在臨床中廣泛應(yīng)用。近年來，動物來源肝素的質(zhì)量問題成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，研究開發(fā)非動物源性肝素的大規(guī)模生產(chǎn)方式成為一大熱點(diǎn)。采用與肝素生物合成前體具有相似結(jié)構(gòu)的細(xì)菌莢膜多糖heparosan作為底物，已成功合成肝素、硫酸乙酰肝素，并獲得多種具有肝素相關(guān)功能的肝素衍生物，是一種較有希望的非動物源性肝素生產(chǎn)方式。本文對此進(jìn)行綜述。

heparosan;肝素;微生物發(fā)酵

肝素(HP)被發(fā)現(xiàn)已90余年，作為抗凝血和抗血栓藥物廣為應(yīng)用。HP還具有降血脂、抗炎、抗過敏、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抑制細(xì)菌黏附等作用［1-2］，是重要的糖胺聚糖(GAG)類生化藥物之一。目前，商品化HP主要是從腸黏膜等組織中提取。2008年在HP使用中，曾因雜質(zhì)過量出現(xiàn)嚴(yán)重的過敏反應(yīng)甚至死亡［3-4］。動物源性HP的質(zhì)量成為廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)，同時也引發(fā)了對非動物來源HP的需求。

微生物多糖的生產(chǎn)以其潛在的生物工程應(yīng)用，得到廣泛關(guān)注。已知有多種細(xì)菌可以產(chǎn)生含GAG樣聚合物的莢膜多糖［5］。目前，透明質(zhì)酸(HA)已實(shí)現(xiàn)細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，而HP等其他重要GAG的大規(guī)模微生物發(fā)酵仍處在探索階段。

動物體內(nèi)HP的二糖單位主要為葡糖胺(GlcN)和艾杜糖醛酸(IdoUA)，GlcN的氨基氮和C6位均帶有硫酸基。HP合成時二糖中是葡糖醛酸(GlcUA)，然后差向異構(gòu)化為IdoUA，并隨之進(jìn)行C2位硫酸化。脊椎動物合成HP的過程是先催化合成多糖heparosan作為前體，然后進(jìn)行一系列的硫酸化及異構(gòu)化修飾［6］。細(xì)菌heparosan的發(fā)現(xiàn)，引起了廣泛關(guān)注。因?yàn)樗雇ㄟ^細(xì)菌合成，化學(xué)或生物修飾生產(chǎn)HP、硫酸乙酰肝素(HS)成為可能。本文就以heparosan為前體的HP類微生物發(fā)酵生產(chǎn)作一綜述。

1 heparosan

肝素前體heparosan又稱 N-acetylheparosan，(-GlcUA-1，4-GlcNAc-1，4-)n(其中GlcUA代表葡糖醛酸;GlcNAc代表乙酰葡糖胺)，是某些細(xì)菌莢膜中多糖骨架的二糖重復(fù)單位，同時也作為HP和HS的生物合成前體，在水螅和脊椎動物中都有發(fā)現(xiàn)［7］。其二糖骨架結(jié)構(gòu)雖與脊椎動物中的HP類似，但未硫酸化，也沒有將GlcUA異構(gòu)化為IdoUA。

圖1 heparosan二糖單位的結(jié)構(gòu)(A)和HP的主要和可變重復(fù)二糖單位(B)

采用生物工程的方法，以heparosan為前體合成HP提供了一種新的、更為安全且較有希望的非動物源性生產(chǎn)方式［8］。目前發(fā)現(xiàn)的莢膜多糖中含heparosan的細(xì)菌有大腸桿菌K5(E.coli K5)和多殺性巴氏桿菌D型(P.multocida type D)。其中P.multocida產(chǎn)生的heparosan平均相對分子質(zhì)量(Mr)較高，為 2.0 ×105～3.0 ×105，而 E.coli K5 heparosan(K5PS)大小與 HP接近，Mr為1.0 ×104～2.0×104。所以，以K5PS為HP、HS生物合成前體的研究開展較多，應(yīng)用也較為廣泛。研究表明，從E.coli K5獲得的重均分子質(zhì)量(Mw)1.0×104以上的heparosan可在酶的作用下轉(zhuǎn)化成類似于HP的具有抗凝血活性的多糖［9-10］。

2 合成方法

脊椎動物HS的生物合成過程是先催化合成GlcUAGlcNAc二糖重復(fù)單位組成的heparosan多糖骨架。經(jīng)N-去乙?；?硫酸轉(zhuǎn)移酶(NDST)作用，將GlcNAc轉(zhuǎn)化成N-磺基葡糖胺(GlcNS)。N-硫酸化后，C5-異構(gòu)化酶(C5-epi)再將部分GlcUA轉(zhuǎn)化成IdoUA。所得多糖經(jīng)2-O-硫酸轉(zhuǎn)移酶(2-OST)，6-O-硫酸轉(zhuǎn)移酶(6-OST)和3-O-硫酸轉(zhuǎn)移酶(3-OST)的修飾分別將磺基加入IdoUA和GlcUA的C2位以及GlcN的C6位和C3位。雖然，酶修飾不一定遵循上述順序，但NDST對GlcNAc的作用決定異構(gòu)化和O-硫酸化的水平［11］。

以heparosan為前體，酶為基礎(chǔ)的HP、HS合成是一種較有希望的非動物源性生產(chǎn)方式。與化學(xué)合成法相比，化學(xué)-酶法合成具有HP、HS生物合成酶的高度區(qū)域選擇性，在合成硫酸化多糖和較大低聚糖中具有顯著優(yōu)勢。HS生物合成途徑的擬態(tài)化學(xué)-酶法或全酶法合成可產(chǎn)生具有特殊生物活性的多種 HS 結(jié)構(gòu)［12］。

研究認(rèn)為，HP類產(chǎn)品的抗凝血活性主要依賴于其多糖鏈中能與抗凝血酶(AT)結(jié)合的五糖序列。Lindahl等［9］以K5PS為底物，化學(xué)法N-去乙?；蚇-硫酸化后，經(jīng)C5-epi作用，將部分GlcUA轉(zhuǎn)化為IdoUA，所得異構(gòu)化N-硫酸化K5PS與N，N-二甲基甲酰胺和吡啶三氧化硫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)全部O-硫酸化，二甲亞砜-甲醇(9∶1)選擇性去硫酸化后，再進(jìn)行GlcN 6-O-硫酸化及N-硫酸化，最終獲得可與AT結(jié)合的特殊“neoheparin”。Kuberan等［13］則采用全酶法合成了ATⅢ結(jié)合五糖。通過選擇適當(dāng)?shù)纳锖铣捎妹赶嘟M合，也可得到具有HP類似結(jié)構(gòu)及抗凝血活性的硫酸化多糖［14］。

HP、HS生物合成過程中所涉及的特異酶已基本克隆得到，已在E.coli中成功表達(dá)16種參與其生物合成的酶(部分見表1)?？蓪?shí)現(xiàn)以 heparosan為前體，經(jīng) NDST、C5-epi、2-OST、3-OST、6-OST 等酶修飾，合成 HP 和 HS［15］。

表1 E.coli中表達(dá)的部分HS生物合成用酶

以heparosan為前體合成HP及其類似物首要解決的就是heparosan的產(chǎn)量問題。Wang等［16］采用優(yōu)化培養(yǎng)基，富氧給予并指數(shù)補(bǔ)加葡萄糖，在7 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)E.coli K5菌株制備 heparosan，產(chǎn)量可達(dá)15 g/L，Mr為5.8 ×104，Mw為8.4×104。此外，還可聯(lián)合應(yīng)用發(fā)酵工程、基因工程和代謝工程等，以獲得具有理想結(jié)構(gòu)特性及較高產(chǎn)量的heparosan，作為生物工程HP生產(chǎn)前體［17］。

3 應(yīng)用

以heparosan為前體可合成HP、HS及多種衍生物，heparosan及其衍生物具有與HP類似的結(jié)構(gòu)，其硫酸化衍生物亦有許多與HP類似的生物活性，主要有抗凝血、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子及抗病毒作用等。以K5PS為前體合成的HP類衍生物見圖2。

圖2 K5莢膜多糖及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)修飾的heparosan可抑制人乳頭狀瘤病毒16(HPV-16)假病毒顆粒與固定化HP間的相互作用，高度O-硫酸化、N，O-硫酸化的多糖衍生物則具有抗成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF-2)活性，抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)、單純皰疹病毒(HSV)和HPV的感染作用等?；前穐eparosan則具有與HP類似的抗凝血和抗蛋白酶活性，能釋放組織因子通道抑制劑，抑制組織因子介導(dǎo)的血小板激活作用［18］。

Munoz等［19］將生物素?；腒5PS固定在傳感器芯片上，用參與HP生物合成的酶選擇性修飾獲得與HP結(jié)構(gòu)類似的多糖，通過檢測這些多糖與ATⅢ的表面等離子體共振確定其相互作用，實(shí)現(xiàn)HP-蛋白質(zhì)相互作用的快速篩選，并可提供參與結(jié)合的關(guān)鍵硫酸化基團(tuán)的結(jié)構(gòu)信息。

4 展望

近年來，HP的非動物源性生產(chǎn)研究較多，有化學(xué)法［20］、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞代謝工程［21-22］等多種方法，其中以heparosan為前體，酶修飾為基礎(chǔ)的HP合成方式是一種較有希望的替代方法，可產(chǎn)生具有特殊生物活性的多種HP產(chǎn)品。相信隨著研究的不斷深入，可實(shí)現(xiàn)HP的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化微生物生產(chǎn)。

［1］Kreuger J，Spillmann D，Li J P，et al.Interactions between heparan sulfate and proteins:the concept of specificity［J］.J Cell Biol，2006，174(3):323-327.

［2］Gu L，Wang H，Guo Y L，et al.Heparin blocks the adhesive of E.coli O157:H7 to human colonic epithelial cells［J］.Food Control，2008，19(12):1119-1125.

［3］Liu H，Zhang Z，Linhardt R J.Lessons learned from the contamination of heparin［J］.Nat Prod Rep，2009，26:313-321.

［4］Guerrini M，Beccati D，Shriver Z，et al.Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in heparin associated with adverse clinical events［J］.Nat Biotechnol，2008，26(6):669-675.

［5］DeAngelis P L.Microbial glycosaminoglycan glycosyltransferases［J］.Glycobiology，2002，12(1):9R-16R.

［6］Busse M，F(xiàn)eta A，Presto J，et al.Contribution of EXT1，EXT2，and EXT3 to heparan sulfate chain elongation［J］.JBiol Chem，2007，282(45):32802-32810.

［7］陳祥娥，凌沛學(xué)，張?zhí)烀?細(xì)菌肝素前體heparosan合酶［J］.中國生化藥物雜志，2008，29(6):422-424.

［8］Laremore TN，Zhang F，Dordick JS，et al.Recent progress and applications in glycosaminoglycan and heparin research［J］.Curr Opin Chem Biol，2009，13(5-6):633-640.

［9］Lindahl U，Li JP，Kusche-Gullberg M，et al.Generation of“Neoheparin”from E.coli K5 capsular polysaccharide［J］.J Med Chem，2005，48(2):349-352.

［10］ Zhang Z Q，McCallum SA，Xie J，et al.Solution structures of chemoenzymatically synthesized heparin and its precursors［J］.J Am Chem Soc，2008，130(39):12998-13007.

［11］ Kusche M，Hannesson H H，Lindahl U.Biosynthesis of heparin.Use of Escherichia coli K5 capsular polysaccharide as a model substrate in enzymic polymer-modification reactions［J］.Biochem J，1991，275(Pt 1):151-158.

［12］ Chen J，Avci F Y，Munoz E M，et al.Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate［J］.JBiol Chem，2005，280(52):42817-42825.

［13］ Kuberan B，Lech M Z，Beeler D L，et al.Enzymatic synthesis of antithrombin III binding heparan sulfate pentasaccharide［J］.Nat Biotechnol，2003，21(11):1343-1346.

［14］ Chen J，Jones C L，Liu J.Using an enzymatic combinatorial approach to identify anticoagulant heparan sulfate structures［J］.Chem Biol，2007，14(9):986-993.

［15］ Peterson S，F(xiàn)rick A，Liu J.Design of biologically active heparan sulfate and heparin using an enzyme-based approach［J］.Nat Prod Rep，2009，26(5):610-627.

［16］ Wang Z Y，Ly M，Zhang F，et al.E.coli K5 fermentation and the preparation of heparosan，a bioengineered heparin precursor［J］.Biotechnol Bioeng，2010，107(6):964-973.

［17］ Wang Z，Dordick J S，Linhardt R J.Escherichia coli K5 heparosan fermentation and improvement by genetic engineering［J］.Bioeng Bugs，2011，2(1):63-67.

［18］陳祥娥，凌沛學(xué).大腸桿菌K5莢膜多糖硫酸化衍生物的應(yīng)用［J］.中國生化藥物雜志，2009，30(6):427-429.

［19］ Munoz E，Xu D，Avci F，et al.Enzymatic synthesis of heparin related polysaccharides on sensor chips:rapid screening of heparin-protein interactions［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，339(2):597-602.

［20］ Petitou M，van Boeckel C A.A synthetic antithrombin Ⅲ binding pentasaccharide is now a drug!What comes next? ［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2004，43(24):3118-3133.

［21］ Bame K J，Lidholt K，Lindahl U，et al.Biosynthesis of heparan sulfate.coordination of polymermodification reactions in a Chinese hamster ovary cell mutant defective in N-sulfotransferase［J］.JBiol Chem，1991，266(16):10287-10293.

［22］ Zhang L，Lawrence R，F(xiàn)razier B A，et al.CHO glycosylation mutants:proteoglycans［J］.Methods Enzymol，2006，416:205-221.

Progress on microbial production of heparin

CHEN Xiang-e1，2，LING Pei-xue1，2
(1.School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Postdoctoral Scientific Research Workstation，Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province，Jinan 250101，China)

TQ929

A

1005-1678(2012)04-0502-03

2011-07-19

陳祥娥，女，博士研究生，微生物與生化藥學(xué)專業(yè);凌沛學(xué)，通信作者，研究員，博士生導(dǎo)師，Tel:0531-81213003，E-mail:peixue.ling@bausch.com。