董 坤，朱希強，王鳳山

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院生化與生物技術(shù)藥物研究所，山東 濟南 250012;2.山東省生物藥物研究院，山東 濟南 250101)

發(fā)酵法生產(chǎn)還原型谷胱甘肽的研究進展

董 坤1，朱希強2，王鳳山1

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院生化與生物技術(shù)藥物研究所，山東 濟南 250012;2.山東省生物藥物研究院，山東 濟南 250101)

谷胱甘肽是一種含有巰基的活性三肽化合物，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品行業(yè)中。此文從發(fā)酵、分子水平和分離純化三個方面綜述了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的研究概況，并對發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的發(fā)展前景進行了展望，旨在為谷胱甘肽在發(fā)酵生產(chǎn)方面的研究提供參考。

谷胱甘肽;發(fā)酵;分離純化;研究進展

谷胱甘肽(glutathione，GSH)又名 γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸縮合形成的生物活性三肽化合物，廣泛存在于動物、植物和微生物細胞中［1］。GSH的存在形式主要有兩種，即還原型谷胱甘肽(reduced glutathione)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)，其中，大約90%以上以還原型谷胱甘肽的形式存在。由于GSH在抗氧化、免疫、解毒等方面有著重要生理功能［2］，目前已廣泛應(yīng)用于臨床、食品和化妝品行業(yè)中。

GSH的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶法和發(fā)酵法等?；瘜W(xué)合成法是以三種前體氨基酸為原料進行化學(xué)合成，但因為所得活性產(chǎn)物不易分離致使產(chǎn)品純度不高而限制了其應(yīng)用。酶法合成是利用三種底物氨基酸和生物體內(nèi)的與GSH合成有關(guān)的酶，通過添加少量ATP(三磷酸腺苷)來合成GSH，該法操作復(fù)雜且成本較高。發(fā)酵法可以利用廉價的生產(chǎn)原料，通過特定的微生物代謝合成GSH，操作簡單，成本較低，且生產(chǎn)速率快，易于擴大規(guī)模。因此，發(fā)酵法生產(chǎn)GSH越來越受到人們的重視。

1 GSH的生物合成途徑

GSH的生物合成由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸通過r-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHⅠ)和谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)催化合成［3］。其中，GSHⅠ是GSH合成中的限速酶，受GSH的反饋抑制。在合成過程中，每合成一分子的GSH需要消耗二分子的ATP。另外，GSH也可以在NADPH(還原型輔酶Ⅱ)存在時通過GSH還原酶將GSSG還原得到。GSH的生物合成途徑如圖1所示。

圖1 GSH的生物合成過程

2 發(fā)酵研究

在微生物界，GSH產(chǎn)生菌主要集中在真核酵母和革蘭陰性菌中。野生型釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母本身具有較高的GSH含量(占細胞干重的0.1% ～1.0%)并且能夠持續(xù)保持GSH的合成能力，因此它們已成為工業(yè)生產(chǎn)GSH最常用的菌種 在發(fā)酵生產(chǎn)中 產(chǎn)量的提高通過兩個途徑來實現(xiàn):一是提高菌體本身細胞內(nèi)GSH的含量;二是提高菌體生物量使GSH的總量提高。

2.1 菌種選育

野生型釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母本身具有較高的GSH合成能力，但其產(chǎn)量只適用于實驗室研究，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)。通過物理誘變或化學(xué)誘變，在特定的培養(yǎng)基上篩選GSH高產(chǎn)菌株是提高菌種產(chǎn)量 性能的主要手段 常用的物理或化學(xué)誘變劑主要有:紫外線、X-射線、γ-射線、甲基磺酸乙酯、亞硝基胍(NTG)等，而特定培養(yǎng)基上的篩選物質(zhì)主要有L-乙硫氨酸、DL-乙硫氨酸、甲硫氨酸、1，2，4-三氮唑等。通過這種傳統(tǒng)的菌種誘變和篩選方式，得到了一系列GSH高產(chǎn)菌株。表1列舉了目前國內(nèi)外通過誘變選育得到的GSH高產(chǎn)菌。

表1 GSH高產(chǎn)菌的國內(nèi)外誘變選育情況

2.2 培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的優(yōu)化

對培養(yǎng)基組成的優(yōu)化主要包括碳源、氮源、無機鹽等的優(yōu)化，而對發(fā)酵條件的優(yōu)化主要是對溫度、pH、溶氧以及接種量等的優(yōu)化。在傳統(tǒng)的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的優(yōu)化中主要采用單因素優(yōu)化，這種方法工作量大，費時、費力。若運用一些實驗設(shè)計方法(如正交實驗設(shè)計、中心復(fù)合實驗設(shè)計［11］、均勻設(shè)計［12］等)和數(shù)據(jù)處理方法(如響應(yīng)面分析［10］、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型［13］等)不但減少了工作量，提高了實驗效率，而且實驗結(jié)果具有更高的可信度和實際應(yīng)用價值。Zhang等［12］利用均勻設(shè)計對發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分進行了優(yōu)化，優(yōu)化后GSH的產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了1.81倍。Shao等［10］首先通過Plackett-Burman設(shè)計從眾多影響因素中篩選得到影響GSH和S-腺苷甲硫胺酸(SAM)產(chǎn)量的顯著因素，然后通過Box-Behnken設(shè)計得到GSH和SAM的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成方案，此方法的成功應(yīng)用，使得GSH和SAM的總產(chǎn)量提高了2.4倍。芐芙蓉等［14］應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計和球面對稱設(shè)計實驗對酵母發(fā)酵生產(chǎn)GSH的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，通過優(yōu)化實驗，發(fā)酵液中谷胱甘肽積累量比優(yōu)化前產(chǎn)量提高約56.2%。同樣，對發(fā)酵條件的優(yōu)化也可以采用實驗設(shè)計的方法。Santos等［15］利用析因設(shè)計和中心復(fù)合實驗設(shè)計研究了溫度、轉(zhuǎn)速、溶氧和葡萄糖濃度對Saccharomyces cerevisiae生產(chǎn)GSH的影響，并發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后GSH產(chǎn)量提高接近4倍。

2.3 發(fā)酵過程的控制

GSH的發(fā)酵過程可以分為細胞生長和GSH合成兩個階段，所以，GSH總量的增加可以分別在這兩個階段通過增加細胞的生物量或者細胞內(nèi)GSH的合成量來實現(xiàn)，而對發(fā)酵過程的控制可以同時從這兩個方面使GSH的總量提高。通過補料分批培養(yǎng)實現(xiàn)高密度發(fā)酵是增加細胞生物量的最成熟和最完善的方法。但是在實際發(fā)酵過程中，由于溶氧、副產(chǎn)物積累等因素影響了細胞的生長，從而難以實現(xiàn)高密度發(fā)酵。所以，在利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)GSH的過程中，通常采用流加補料的方式來延長細胞對數(shù)生長期和穩(wěn)定期，從而得到高濃度的菌體密度。GSH的合成與發(fā)酵液中葡萄糖的濃度密切相關(guān)，如果葡萄糖濃度超過一定值時會發(fā)生Crabtree效應(yīng)，從而抑制細胞的生長，因此發(fā)酵過程中葡萄糖的供給模式非常重要。陳堅等［16］比較了恒速流加、人工反饋控制流加和指數(shù)流加3種補糖策略對重組大腸桿菌高密度發(fā)酵合成GSH的影響，發(fā)現(xiàn)指數(shù)流加的方式最為理想，認為指數(shù)流加在提高菌體濃度、生產(chǎn)強度和GSH總量方面具有顯著優(yōu)勢。

2.4 前體氨基酸和ATP的添加

GSH的生物合成需要谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸等前體氨基酸，所以在GSH發(fā)酵過程中添加適量的前體氨基酸可以有效地增加GSH在細胞內(nèi)的積累。研究表明，L-半胱氨酸是GSH產(chǎn)量提高的關(guān)鍵氨基酸，但過量的半胱氨酸會對細胞生長產(chǎn)生抑制作用［17］。所以，在GSH發(fā)酵過程中如何優(yōu)化三種前體氨基酸的添加方式，使前體氨基酸能促進GSH的合成但不會對細胞的生長產(chǎn)生抑制作用是至關(guān)重要的。尹良鴻等［18］研究了利用產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)GSH的氨基酸添加策略，發(fā)現(xiàn)在3 L發(fā)酵罐中發(fā)酵36 h時流加葡萄糖的同時添加20 mmol/L L-胱氨酸，45 h時添加混合氨基酸(L-谷氨酸40 mmo/L，L-半胱氨酸40 mmol/L，甘氨酸60 mmol/L)，最終GSH產(chǎn)量達1 725.3 mg/L，比高密度培養(yǎng)提高了111.4%。然而，在前體氨基酸添加過程中，由于半胱氨酸極易被氧化，大部分半胱氨酸在被細胞利用之前已被氧化為胱氨酸，降低了半胱氨酸的利用率。針對這一點，Liang等［19］研究了溶氧水平對半胱氨酸利用率的影響，發(fā)現(xiàn)在添加半胱氨酸后的3 h內(nèi)溶氧控制在5%，之后的12 h將溶氧控制在20%，可減少半胱氨酸添加量，使GSH產(chǎn)量提高13%。

GSH在細胞內(nèi)合成是一個耗能過程，所以在發(fā)酵過程中添加適量的ATP可以在一定程度上提高GSH的合成。Liang等［20］研究了在產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵過程中，在添加前體氨基酸的基礎(chǔ)上添加ATP發(fā)現(xiàn)GSH產(chǎn)量達到2 043 mg/L，較對照高出11%，證明了ATP對GSH的合成有提高作用。但是直接添加ATP不僅價格昂貴，而且反應(yīng)產(chǎn)生的ADP(二磷酸腺苷 對 Ⅰ的活性產(chǎn)生抑制作用 所以構(gòu)建高效經(jīng)濟的ATP再生系統(tǒng)對提高GSH的產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本有重要的意義。Lin等［21］利用重組 E.coli add/ade(pBV03)和S.cerevisiae WSH2構(gòu)建了一個生物合成GSH的種間耦合系統(tǒng)，降低了耦合系統(tǒng)中從腺苷到次黃嘌呤的不可逆轉(zhuǎn)化，保證了耦合系統(tǒng)中ATP再生的效率。最終證明，該耦合系統(tǒng)GSH的合成量達到10.08 mmol/L，為對照組的4.03倍。

2.5 脅迫劑的添加

Riccillo等［22］的研究闡述了GSH對于保護細胞在外界脅迫作用下和極端環(huán)境下生存具有重要作用。利用微生物細胞的這種生理應(yīng)答特性，人為地添加氧化劑和提高發(fā)酵液滲透壓都對酵母細胞起到刺激作用，而酵母細胞可利用自身的應(yīng)激反應(yīng)能力，合成更多的GSH以抵御不良環(huán)境的刺激［23］。Liang等［24］利用 GSH 可以抵御 H2O2產(chǎn)生的自由基這一特性，考察了不同時間不同濃度H2O2脅迫對產(chǎn)朊假絲酵母合成GSH的影響，發(fā)現(xiàn)利用H2O2的連續(xù)脅迫可使GSH的產(chǎn)量提高54.6%。

在發(fā)酵液中添加ATP可以提高GSH的合成效率。但是，有研究表明由于細胞膜本身通透性的限制，只有21%的ATP能夠進入細胞被利用［25］。因此，采取適當?shù)拇胧└淖兗毎さ耐ㄍ感约瓤梢蕴岣逜TP的利用效率，又可以將GSH釋放到細胞外從而解除GSH的過量積累對GSHⅠ的反饋抑制。Nie等［26］在利用產(chǎn)朊假絲酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)GSH的基礎(chǔ)上，考察了低pH脅迫對GSH合成的影響，結(jié)果表明，在發(fā)酵24 h后將pH由5.5降至1.2并維持6 h，細胞內(nèi)的GSH幾乎全部釋放到細胞外，GSH的最終產(chǎn)量提高了24.9% 。除此之外，添加 NaCl［27］、表面活性劑(如 SDS［28］、吐溫80［29］)等可改變細胞膜通透性的方法也都提高了GSH的產(chǎn)量。

3 分子水平研究

在GSH的生物合成過程中天然的GSH合成酶系活力都較低，利用基因工程技術(shù)，通過對編碼E.coli中GSHⅠ和GSHⅡ的基因進行克隆重組來提高其活力，并分別在E.coli和酵母菌中進行高效表達，可提高GSH的合成能力［30］。Liao等［31］通過在大腸桿菌中表達2個拷貝數(shù)的GSHⅠ和1個拷貝數(shù)的GSHⅡ來提高GSH合成酶系的活力，結(jié)果表明GSH的產(chǎn)量達到34.8 mg/g(細胞濕重)，是目前所報道的在E.coli中表達產(chǎn)量最高的。Fei等［32］利用畢赤酵母表達效率高、易實現(xiàn)高密度培養(yǎng)等優(yōu)點，將釀酒酵母的GSHⅠ和GSHⅡ的基因融合GAP強啟動子在畢赤酵母中表達，發(fā)現(xiàn)重組菌GSH的產(chǎn)量達到217 mg/L，通過在5 L發(fā)酵罐上進行補料分批培養(yǎng)和前體氨基酸添加，最終GSH的產(chǎn)量達到4.15 g/L。

4 分離純化研究

GSH是胞內(nèi)產(chǎn)物，需要從細胞內(nèi)將GSH提取出來，提取的主要方法有細胞破碎法和抽提法。由于細胞破碎法在GSH釋放出來的同時也將蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等釋放出來，從而不利于后續(xù)的分離純化。抽提法是通過物理或化學(xué)方法改變細胞壁的通透性使GSH釋放出來的方法，較為常用。周迪楠等 考察了分別利用熱水抽提 甲酸抽提 乙醇抽提、硫酸抽提、三氯乙酸抽提、有機酸抽提、低溫抽提等方法從酵母中抽提GSH的效果，發(fā)現(xiàn)利用熱水抽提法的效率高、耗時短、經(jīng)濟且無污染。王曉菊等［34］通過正交試驗優(yōu)化了熱水抽提法的抽提條件，并在此基礎(chǔ)上加入一定量的高氯酸，使GSH的抽提率和回收率進一步提高。另外，乙醇抽提法憑借其價廉、簡便且有效的特點也受到關(guān)注。Xiong等［35］使用乙醇抽提法提取釀酒酵母中的GSH，通過全因子析因設(shè)計(FFD)優(yōu)化了乙醇濃度、提取時間和提取溫度，結(jié)果表明乙醇的濃度對抽提效率有很大影響，并且乙醇抽提法不破壞細胞的完整性，簡便了后期純化，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

目前報道的GSH的分離純化方法主要有4種:(1)銅鹽法。該法具有工業(yè)使用價值，但因產(chǎn)生大量的H2S氣體而逐漸被淘汰;(2)離子交換樹脂法。由于其高經(jīng)濟效益，該法已被越來越多的研究者使用，如王淼等［36］采用兩步陽離子交換樹脂法，通過第一步離子交換除去部分雜質(zhì)，第二步離子交換集中純化，最終酵母提取液中GSH的回收率大于70%，純化倍數(shù)大于100倍;(3)雙水相法。該法是利用GSH在雙水相中的不同分配，達到與發(fā)酵液中其它雜質(zhì)分離的目的，具有簡便、能耗低、易于規(guī)模化及能保持生物活性的特點。Wu等［37］采用PEG/葡聚糖和PEG/鹽的雙水相系統(tǒng)從離心除菌后的發(fā)酵液中萃取 GSH，GSH的總萃取率達83.55%。但雙水相系統(tǒng)的成本較高，還只適用于實驗室研究;(4)親和色譜法。Zhao等［38］報道了利用固定化金屬離子親和層析提純GSH的方法，依據(jù)巰基化合物與Zn2+有很強的親和作用，將Zn2+固定到硫脲樹脂上制成含鋅硫脲樹脂，用于提純酵母提取液中的GSH，最終GSH的回收率達到91.22%且避免了重金屬污染。

5 展望

近年來，GSH在醫(yī)藥、食品等工業(yè)中的應(yīng)用越來越廣。雖然目前國內(nèi)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GSH的研究逐漸增多，但是大部分還只是在實驗室階段，工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)還不夠成熟，GSH的供應(yīng)仍然主要依賴日本等發(fā)達國家進口。因此，要提高GSH的發(fā)酵水平，還需加大工業(yè)化技術(shù)的研究強度，可從幾方面開展工作:(1)通過常規(guī)誘變育種篩選到更優(yōu)良的GSH高產(chǎn)、穩(wěn)定的菌株，并根據(jù)GSH的合成和代謝途徑，進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，通過建立動力學(xué)模型對生產(chǎn)進行評估;(2)在GSH分批發(fā)酵過程中，存在溶氧不足、底物抑制、葡萄糖效應(yīng)、代謝阻礙等問題，不適合工業(yè)化的生產(chǎn)，應(yīng)在補料分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵方面進行深入的研究;(3)加強GSH生物合成的分子生物學(xué)研究，并指導(dǎo)GSH高產(chǎn)菌種的基因工程和代謝工程改良;(4)建立高效的產(chǎn)品分離、純化回收工藝，獲得具有自主知識產(chǎn)權(quán)的GSH生產(chǎn)技術(shù)。

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Research advances of glutathione production by fermentation

DONG Kun1，ZHU Xi-qiang2，WANG Feng-shan1
(1.Institute of Biochemical and Biotechnological Drugs，School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province，Jinan 250101，China)

TQ464.7

A

1005-1678(2012)04-0511-04

2011-09-22

董 坤，男，碩士研究生，微生物與生化藥學(xué)專業(yè)，E-mail:don_king@163.com;王鳳山，通信作者，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:fswang@sdu.edu.cn。