郭 冉，劉潔婷，吳 丹，劉海峰，初彥輝

(牡丹江醫(yī)學院 1.生理教研室，2.黑龍江省抗纖維化生物治療重點實驗室，黑龍江 牡丹江 157011)

重組人轉化生長因子β1原核表達及多克隆抗體制備

郭 冉1，劉潔婷2，吳 丹2，劉海峰2，初彥輝2

(牡丹江醫(yī)學院 1.生理教研室，2.黑龍江省抗纖維化生物治療重點實驗室，黑龍江 牡丹江 157011)

目的 克隆人轉化生長因子β1(TGF-β1)基因，原核表達TGF-β1蛋白，制備兔抗人TGF-β1多克隆抗體。方法 應用RT-PCR技術擴增人TGF-β1基因序列，構建pET-28a-TGF-β1重組質粒。轉化至E.coli BL21(DE3)中，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導表達。Western-blot檢測目的蛋白的抗原性。免疫新西蘭白兔，獲得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清。飽和硫酸銨鹽析法純化多克隆抗體，間接ELISA法檢測多克隆抗體效價，Westernblot技術進行抗體特異性檢測。結果 獲得了TGF-β1編碼序列和表達載體，目的蛋白主要存在于超聲破碎后的包涵體中;經Western-blot檢測目的蛋白存在抗原性;獲得純化的兔抗人多克隆抗體效價達1∶10 000。結論 獲得的兔抗人TGF-β1多克隆抗體效價較高，具有良好的特異性。

轉化生長因子β1;抗纖維化;原核表達;多克隆抗體

轉化生長因子β(TGF-β)對瘢痕成纖維細胞的生物學效應起到主要的調控作用并參與瘢痕形成中的調節(jié)活動，目前研究最為廣泛［1-2］。TGF-β被認為是促進纖維化發(fā)展的最重要的生長因子［3］。在創(chuàng)傷中TGF-β1的表達增加，同時還能刺激成纖維細胞產生內源性TGF-β1，甚至加入外源性的 TGF-β1可以增加創(chuàng)傷中膠原纖維蛋白和炎性細胞的數(shù)量［4-5］。正反饋刺激作用 TGF-β1可加速體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩細胞增殖和分裂并促進膠原的基因表達和蛋白合成

陳永平等［7］曾提出將 TGF-β1構建為疫苗，刺激機體產生抗體，中和體內產生的過量的TGF-β1。相關文獻報道，抗TGF-β1抗體具有中和TGF-β1活性的作用［8］，anti-TGF-β1抗體能明顯抑制成纖維細胞的超微結構，能抑制成纖維細胞的增殖和膠原合成［9］。

本實驗通過原核表達TGF-β1蛋白，以該蛋白作為抗原，在動物體內制備多克隆抗血清，并檢測該抗體的特異性，為進一步研究TGF-β1與纖維化的關系提供相應的實驗基礎。

1 材料

載體 pET-28a、E.coli DH5α、E.coli BL21 菌株由本實驗室保存;引物序列遞交上海生工生物工程技術有限公司合成;Trizol Reagent為Invitrogen公司產品;逆轉錄酶、限制性內切酶、T4 DNA連接酶及Pfu DNA聚合酶均為寶生物工程(大連)有限公司產品;BCA蛋白定量試劑盒購于蓋寧生物科技(北京)有限公司;UPS-蛋白質銀染試劑盒由溫州安得森生物科技有限公司惠贈;兔抗-TGFβ1抗體、HRP標記的羊抗兔IgG抗體購于北京博奧森生物技術有限公司。

雄性新西蘭白兔3只購自黑龍江省中醫(yī)藥大學動物中心。

2 方法

2.1 TGF-β1 基因的構建

參照Gene bank數(shù)據(jù)庫提供的人TGF-β1的cDNA序列設計引物，為方便克隆在上下游引物的5'端分別加入NdeⅠ和HindⅢ酶切位點。

引物序列:5'GATGGGAATTCCATATGGCCCTGGACACCAACTATTG3'

5'ACTGCCCAAGCTTGCTGCACTTGCAGGAGCG3'

采用Trizol Reagent試劑抽提人血中總RNA，RT-PCR 方法逆轉錄合成 cDNA［10］。

2.2 TGF-β1 表達載體的構建

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠分離，回收的基因與載體pET-28a質粒經限制性內切酶NdeⅠ和HindⅢ進行雙酶切，用T4連接酶進行連接，得到pET-28a-TGF-β1重組質粒。重組質粒轉化至 E.coli DH5α，對重組子進行酶切鑒定，陽性克隆進行測序。

2.3 TGF-β1 蛋白的表達

將測序正確的重組基因轉化至E.coli BL21中，得到表達菌株 pET-28a-TGF-β1/BL21，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導表達。離心收集菌體。菌體重懸于磷酸鹽緩沖液(PBS)30 mL中。冰浴下，超聲破碎重懸菌。包涵體復性處理。取復性后透析后液體進行SDS-PAGE分析。應用常規(guī)方法測定復性后目的蛋白濃度［11］。Western blot檢測蛋白抗原性。

2.4 多克隆抗體的制備

取復性后的蛋白和等體積弗氏完全佐劑充分乳化，皮下多點注射新西蘭白兔，每只用量為0.5 mg;14 d后用弗氏不完全佐劑加強免疫1次。共加強免疫3次，后兩次加強免疫直接靜脈注射不含佐劑的抗原0.5 mg。第21天開始耳緣靜脈取血檢測效價，末次免疫7 d后頸總動脈采血收集抗血清，分裝后－80℃保存。

2.5 多克隆抗體的純化

采用飽和硫酸銨鹽析沉淀法純化抗體［12］。①取兔血清10 mL與等體積生理鹽水混合后，于攪拌下緩慢滴加SAS(飽和硫酸銨溶液)20 mL，于4℃緩慢攪拌3～4 h，使蛋白充分沉淀;②4℃，3 000 r/min離心30 min，棄上清，用生理鹽水6 mL溶解沉淀，緩慢滴加SAS 4 mL，4℃緩慢攪拌1 h;③重復②;④4℃離心，用生理鹽水6.7 mL溶解沉淀，滴加SAS 3.3 mL，4℃緩慢攪拌1 h;⑤重復④;⑥4℃離心，用10 mmoL/L PBS(pH 7.4)2 mL 溶解沉淀，PBS透析，更換3次PBS，4℃緩慢搖動過夜，得到抗血清，分裝后置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 檢測多克隆抗體的效價

間接ELISA法檢測純化后多抗兔血清效價，10 mmoL/L PBS倍比稀釋(1∶200 ～1∶25 600)多抗血清，同時取免疫前血清1∶500稀釋，作為陰性對照。每組3個復孔。

2.7 SDS-PAGE、Western blot檢測抗體

取純化后的抗血清，進行SDS-PAGE檢測，確定純化后抗血清中免疫球蛋白的含量以及純化的效果。取未誘導的空菌及復性后的TGF-β1蛋白10 μL，以純化后的兔抗人TGF-β1多克隆抗體作為一抗(1∶10 000)，以HRP標記的羊抗兔酶標抗體作為二抗進行Western blot檢測抗體的特異性。

3 結果

3.1 TGF-β1 基因構建

利用RT-PCR方法，以人外周血cDNA為模板，擴增TGF-β1基因。如圖1所示，其PCR擴增產物大小約為360 bp，與實驗設計一致。

3.2 TGF-β1 表達載體的構建

陽性克隆質粒用限制性內切酶NdeⅠ和HindⅢ雙酶切進行鑒定。結果如圖2所示。獲得的目的片段大小與實際相符。陽性克隆重組質粒遞交中美泰和生物技術(北京)有限公司進行序列測定，測序結果表明插入序列和通讀框均正確。

圖1 TGF-β1基因片段的PCR擴增Fig.1 The PCR production of TGF-β1 gene fragment

圖2 重組質粒雙酶切鑒定Fig.2 Identification of pET-28a-TGF-β1 recombinant plasmid using double digests method

3.3 TGF-β1 蛋白的表達

經12%SDS-PAGE檢測，目的蛋白主要存在于包涵體中。測定復性后目的蛋白濃度為3.5 mg/mL。SDS-PAGE檢測結果如圖3所示。約16 kD的位置上出現(xiàn)特異條帶，符合目的蛋白理論推算值。

圖3 SDS-PAGE分析TGF-β1表達Fig.3 SDS-PAGE analysis for the expression and purity of TGF-β1 protein

3.4 Western blot檢測目的蛋白的抗原性

一抗為兔抗人TGF-β1多抗，二抗為HRP標記的羊抗兔IgG，結果如圖4，經過比對確定，在約16 kD處顯示單一條帶，證實經純化后的TGF-β1蛋白具有抗原性，可以應用于下一步抗體的制備。

圖4 免疫印跡分析TGF-β1蛋白Fig.4 Western-blot analysis for the TGF-β1 protein

3.5 多克隆抗體效價測定

SAS鹽析沉淀法純化抗體，間接ELISA方法檢測抗體效價，純化后抗體效價達1∶12 800。純化后的抗血清經還原型SDS-PAGE檢測，結果如圖5，主要蛋白條帶在約50 kD位置，符合兔IgG基本特征，另外，在20 kD左右出現(xiàn)較彌散的條帶，為IgG輕鏈分子。

圖5 SDS-PAGE分析多克隆抗體Fig.5 SDS-PAGE analysis for polyclonal antibody

3.6 Western blot檢測抗體

以純化后的多克隆抗體作為一抗，與未誘導空菌及復性后的 TGF-β1蛋白進行Western blot免疫印跡分析，結果如圖6所示。結果表明，多克隆抗血清與TGF-β1目的蛋白分子質量位置發(fā)生反應，說明制備的多克隆抗體能與目的蛋白特異性結合。

4 討論

抗TGF-β1抗體，作為TGF-β1有效的拮抗劑，能競爭性抑制TGF-β1與其受體結合，阻斷其生物活性，從而避免或者減輕TGF-β1對機體產生的不利影響，并對各種器官的纖維化治療起到一定的作用。一些研究TGF-β與瘢痕形成的關系發(fā)現(xiàn)，應用抗TGF-β抗體可能會減輕瘢痕。

目前，對TGF-β抗體的研究多為體外實驗，且TGF-β抗體成品比較昂貴，使其應用受到限制。本實驗以原核表達獲得的TGF-β1蛋白作為抗原，在動物體內制備多克隆抗血清。經飽和硫酸銨鹽析法純化后，間接 ELISA檢測多克隆抗體效價達1∶10 000以上。SDS-PAGE 分析及 Western blot檢測，本研究所獲得的兔抗人TGF-β1多克隆抗體純度較高，能與TGF-β1目的蛋白特異性結合。為進一步研究與TGF-β1密切相關的疾病，特別是抗纖維化的研究提供了有利條件，奠定了物質基礎。

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Recombinant human TGF-β1 prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation

GUO Ran1，LIU Jie-ting2，WU Dan2，LIU Hai-feng2，CHU Yan-hui2
(Mudanjiang Medical University，1.Department of Physiology，Heilongjiang Key Laboratory of Anti-fibrosis Biotherapy，Mudanjiang 157011，China)

Purpose To clone human TGF-β1 gene and prokaryotic expression of TGF-β1 protein through the expression of this gene，and then to get the rabbit-anti-human TGF-β1 polyclonal antibody from the immune rabbit with this protein.Methods Using RT-PCR technique to amplified human TGF-β1 gene sequence.Then the target gene was cloned into a prokaryotic expression vector pET-28a by using the recombinant DNA technique.After induced by IPTG，the protein TGF-β1 was expressed in E.coli BL21(DE3).The protein testified its antigenicity by Western-blot.Next，we immunized New Zealand white rabbits with the obtained recombinant protein as antigen.We collected the immune sera of rabbit.Then purified antibody by ammonium sulfate fractionationthen，the indirect Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the polyclonal antibodies titer.Western-blot techniques were used to identify antibody specificity.Results The encoding sequence and expression vector of TGF-β1 was obtained while the interest protein was mainly expressed in the inclusion body.Western-blot detection of the target protein displays antigenicity.The purified rabbit anti-human polyclonal antibodies titer is 1∶10 000.Conclusion The rabbit anti-human TGF-β1 polyclonal antibodies titer is higher and has a better specificity.

TGF-β1;anti-fibrosis;prokaryotic expression;polyclonal antibody

Q78

A

1005-1678(2012)04-0354-04

2011-09-16

黑龍江省自然基金(D2007-99);黑龍江省高等教育學會高等教育科學研究“十一五”規(guī)劃課題(開放省重點實驗室對創(chuàng)新人才培養(yǎng)的改革與探索)

郭 冉，男，碩士，助教，E-mail:guoran1980@sina.com;初彥輝，男，通信作者，教授，碩士生導師，Tel:0453-6984634，E-mail:yanhui_chu@sina.com。