張文靜，黃啟來，華子春，2

(1．澳門科技大學中醫(yī)藥學院澳門藥物與健康應用研究所中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室，澳門;2．南京大學 醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室，江蘇南京 210093)

癌癥細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的顯著特征。癌細胞脫離原發(fā)灶侵入周圍組織隨后在遠處形成繼發(fā)性腫瘤，是目前臨床癌癥治療失敗和患者死亡的主要原因［1］。30%的患者在診斷為肺癌時就已經(jīng)有遠處的轉(zhuǎn)移，50% ～60%在治療過程中發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，超過80%的肺癌患者死亡是由轉(zhuǎn)移性疾病引起的［2］。從天然植物中尋找抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的有效成分已成為目前研究的熱點［3］。木犀草素(luteolin;3'，4'，5，7-三羥基黃酮)是廣泛存在于自然界中的天然黃酮類化合物。因其具有廣泛的藥理學活性，長期以來在民間被人們用來治療多種疾病，如高血壓、炎癥和腫瘤［4］。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素能有效抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移。在卵巢癌細胞中木犀草素能抑制ERK信號通路的活化，減少 MMP9的分泌，抑制腫瘤的侵襲［5］。木犀草素(50 μmol·L－1)可抑制人非小細胞肺癌細胞的轉(zhuǎn)移，促進細胞的凋亡，但具體機制不清［6］。

本實驗以人肺腺癌A549細胞株為研究對象，考察木犀草素作用于A549細胞后細胞運動能力的改變，最后對其相關(guān)機制進行探討。

1 材料和方法

1． 1 藥品和試劑

木犀草素購自美國Sigma公司;二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Amersco公司;胎牛血清(fetal bivine serum，F(xiàn)BS)、F-12K培養(yǎng)基、0.05%Trypsine-EDTA，鏈青霉素混合液(100×)購自美國 Gibco公司。實驗前，木犀草素溶于DMSO，母 液 濃 度 為 50 mmol·L－1，DMSO 終 濃度＜0.1%，對細胞生長無影響。

1． 2 實驗材料

人肺腺癌細胞株A549購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)。細胞在10% 的胎牛血清、100 U·ml－1青霉素和 100 μg·ml－1的F-12K培養(yǎng)基，37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1． 3 細胞活力檢測

取對數(shù)生長期的 A549細胞，以3×104ml－1細胞密度每孔100 μl接種于96孔板內(nèi)，37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。次日，加入不同濃度的木犀草素(0、15、30、45、60 μmol·L－1，每個濃度設(shè)立 3 個平行孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。孵育結(jié)束后，每孔先用PBS洗滌除去血清及殘存藥物，隨后加入100 μl含MTT(50 μg)無血清培養(yǎng)基 F-12K，繼續(xù)于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。孵育結(jié)束后，小心吸棄上清液，加入 100 μl的 DMSO，在水平振蕩器上振蕩10 min，充分溶解甲臢。酶標儀測570 nm，參考波長630 nm處吸光度值，用下列公式計算藥物對細胞的抑制率:

抑制率%=(1－處理組吸光度值)/對照組吸光度值×100%

1． 4 傷口愈合實驗

取對數(shù)生長期的A549細胞，以1×105ml－1細胞密度接種于12孔板內(nèi)，37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞密度達到90%，撤去含血清培養(yǎng)基，改用無血清的F-12K饑餓細胞12 h。采用200 μl移液槍頭在培養(yǎng)孔中央處造成損傷，形成寬度均一的傷口，隨后用PBS洗去脫落的細胞。給予15 μmol·L－1木犀草素，同時設(shè)立不含藥物對照組，分別于損傷后0、24、48 h于倒置顯微鏡(IX71，Olympus，日本)10倍下進行拍照記錄細胞向損傷區(qū)域的運動情況。

1． 5 Western blotting檢測蛋白表達

取對數(shù)生長期的A549細胞，接種于6孔板內(nèi)，待細胞貼壁后，給予不同濃度木犀草素的培養(yǎng)液，處理細胞24 h。藥物孵育結(jié)束后，用預冷的PBS洗滌細胞2次，每孔加入200 μl細胞裂解液，用細胞刮刮下細胞后，收集于1.5 ml的Eppendorf管內(nèi)，冰上靜置30 min。后采用12 000×g 4℃離心30 min。轉(zhuǎn)移上清液至新的Eppendorf管內(nèi)。取少許用于Bradford法測定蛋白質(zhì)含量。加入4×上樣緩沖液于蛋白溶液內(nèi)，100℃金屬浴加熱10 min使蛋白變性。采用8%的SDS-PAGE電泳分離蛋白隨后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%的脫脂牛奶封閉 2 h，兔抗 p-FAK(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)、兔抗FAK、鼠抗GAPDH分別與膜進行孵育，4℃過夜。PBST緩沖液洗滌膜3次，每次10 min。采用IRDye 800CW anti-mouse與anti-rabbit secondary IgG二抗室溫避光孵育1 h。孵育結(jié)束后，繼續(xù)于避光條件下，用PBST洗滌膜3次，每次10 min。Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR Biosciences，Lincoln，NE，USA)，分辨率為 84 μm，800 nm 遠紅外通道進行蛋白信號的檢測。信號強度運用Odyssey system application軟件(version 2.1)進行分析。

1． 6 統(tǒng)計學處理

各實驗均重復3次，數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 5.0軟件進行單因素方差分析，后采用Dunnett multiple comparison檢驗對不同藥物濃度處理組與對照組進行比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2． 1 木犀草素對A549細胞增殖的抑制作用

采用MTT法考察木犀草素對A549細胞增殖的抑制作用，木犀草素劑量依賴性地抑制A549細胞的增殖，IC50為 54.4 μmol·L－1(圖1)。與對照組相比，木犀草素在15、30、45 和60 μmol·L－1劑量下對細胞的抑制率分別為(10.62±6.7)%、(36.28±4.22)%、(46.39±3.86)%和(48.04±2.16)%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 木犀草素對細胞活力的影響A549 cells were treated with different concentration of luteolin for 24 h． The cell viability was evaluated by MTT assay． The experiment was carried out three times，each experiment was done in triplicate，a P ＜0.05，b P ＜0.001Fig 1 The effect of luteolin on cell viability in A549 cells

2． 2 木犀草素抑制A549細胞的運動

傷口愈合實驗顯示，15 μmol·L－1的木犀草素作用于A549細胞24 h后，其損傷區(qū)域?qū)挾却笥诳瞻讓φ战M。如圖2，木犀草素 15 μmol·L－1即能抑制 A549 細胞向損傷區(qū)域的運動。

2． 3 木犀草素抑制FAK磷酸化

蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，木犀草素15、30、45 和 60 μmol·L－1作用于 A549 細胞 24 h 后，F(xiàn)AK酪氨酸Tyr397磷酸化水平下降。此外，木犀草素劑量依賴性減少FAK總蛋白的水平，見圖3。

3 討 論

腫瘤的轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學特征之一。FAK是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，作為細胞內(nèi)的骨架蛋白參與了多種信號的傳遞。FAK的高表達與腫瘤的惡性程度緊密相關(guān)［7-8］。在非小細胞肺癌中，F(xiàn)AK及其397位酪氨酸的磷酸化升高預示著腫瘤有較高的侵襲性和不良預后［9］。Huang等［10］用木犀草素、槲皮素以及FAK-siRNA干擾的手段處理胰腺癌細胞株，發(fā)現(xiàn)木犀草素能抑制FAK的表達和活性，并且能抑制胰腺癌細胞的侵襲能力。在肺癌細胞A549的研究中也發(fā)現(xiàn)，木犀草素(50 μmol·L－1)具有抑制A549細胞體外運動的能力，改變細胞骨架，誘導細胞的凋亡，但具體機制不清［6］。故本研究首先考察木犀草素對A549細胞的細胞活力的影響，隨后觀察木犀草素對細胞運動的影響并進一步揭示了其相關(guān)的機制。

圖2 傷口愈合實驗考察木犀草素作用A549細胞24 h和48 h后對細胞運動的影響(白色區(qū)域代表損傷區(qū)域的寬度)Fig 2 The effect of luteolin in A549 cells at 24 h and 48 h by wound healing assay(The white lines represent the distance of wound healing area)

我們發(fā)現(xiàn)，木犀草素(15 μmol·L－1)在對細胞生長抑制僅為(10.62±6.7)%的條件下，卻能顯著抑制人肺腺癌A549細胞株的運動，且呈時間依賴性。文獻報道，木犀草素在 A549細胞中 IC50為(32.6±2.6)μmol·L－1，高于 IC50濃度的木犀草素 50 μmol·L－1抑制肺癌細胞遷移，且該濃度誘導細胞凋亡的發(fā)生。目前，臨床抗腫瘤藥物和篩選得到的活性化合物中，抗腫瘤活性的發(fā)揮主要通過細胞毒作用，一定程度上對機體的正常細胞也產(chǎn)生毒副作用。因此，探索對正常細胞生物學影響較小，而對腫瘤細胞惡性生物學行為有抑制作用的治療靶點和治療窗口，對腫瘤的治療具有重要意義。我們認為，細胞運動能力的減弱在前文提及的研究中很難與藥物所選濃度的細胞毒作用分開，無法反映藥物真實的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥效。在我們的研究中，采用低于IC50的藥物濃度作用于A549細胞，發(fā)現(xiàn)能顯著抑制細胞的運動能力。進一步蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)，木犀草素抑制FAK磷酸化水平;同時，降低FAK總蛋白的表達水平。

圖3 Western blotting檢測不同濃度木犀草素對FAK及磷酸化FAK的影響Fig 3 Western blotting demonstrated the protein level of total FAK and phosphorylation of FAK

腫瘤的轉(zhuǎn)移是多步驟、許多信號分子參與并發(fā)生相互作用的過程。我們的研究揭示了木犀草素抗A549細胞遷移的分子生物學基礎(chǔ)與FAK緊密相關(guān)。新近文獻報道木犀草素抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移與增加E-cadherin表達有關(guān)，后者的增加使細胞間黏附能力增強，侵襲能力減弱［11］;肝細胞生長因子受體參與細胞的遷移，木犀草素也能抑制該信號通路的活化從而發(fā)揮抗HepG2細胞侵襲的能力［12］;此外，木犀草素可抑制NF-κB信號通路，從而阻斷其下游調(diào)控細胞侵襲性行為的關(guān)鍵分子Twist和MMPs的表達［13］。綜上，木犀草素抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移可能是多種信號通路參與的共同結(jié)果。肺癌是嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤，高居我國惡性腫瘤致死的首位［14］。我們的結(jié)果為肺癌的抗轉(zhuǎn)移研究提供了新的靶點。

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