呂磊，孟慶欣，徐軍，宮劍濱，承燕，江時森

(1．南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院 臨床學(xué)院，江蘇南京 210002;2．南京軍區(qū)南京總醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 南京 210002;3．南京軍區(qū)南京總醫(yī)院超聲診斷科，江蘇南京 210002)

血運重建術(shù)已經(jīng)成為縮小急性心肌梗死后最終梗塞面積，保存左室功能，改善臨床預(yù)后的最有效的方法，但同時也能導(dǎo)致嚴(yán)重的缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)損傷。如何減輕心肌IR損傷一直是冠心病防治中亟待解決的重要問題［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，再灌注時磷脂酰肌醇-3激酶 (phosphatidylinositol-3-OH kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)的激活是心肌保護(hù)的重要機制之一，能通過激活下游靶目標(biāo)，促進(jìn)心肌細(xì) 胞 存 活 和 縮 小 梗 死 面 積［2］。川 芎 嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是中藥川芎的有效單體成分，具有抗血小板聚集、擴(kuò)張小動脈、改善微循環(huán)及活血化淤等作用，在心血管疾病中有重要的應(yīng)用前景。本研究擬探討川芎嗪對在體大鼠心肌IR的保護(hù)作用和量效關(guān)系及其可能作用機制，為臨床防治心肌IR損傷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1． 1 實驗動物

健康雄性SD大鼠56只，體質(zhì)量250～280 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實驗動物中心提供。

1． 2 藥物和試劑

川芎嗪(中國藥品生物制品檢定所)，渥曼青霉素、三苯基氯化四氮唑(TTC)(Sigma-Aldrich公司)，抗Akt、抗磷酸化Akt(serine 473)、抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、抗磷酸化eNOS(serine 1177)多克隆抗體(CST公司)，辣根過氧化酶羊抗兔IgG抗體(Sigma公司)，蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(Thermo Scientific公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程公司)。

1． 3 實驗儀器

小動物呼吸機TKR200C型(江西省特立麻醉呼吸設(shè)備公司)，美國 Polytron MR2100勻漿器，美國 BIORAD電泳儀，日立7600型全自動生化分析儀。

1． 4 實驗方法

1．4．1實驗分組 大鼠隨機分成6組。(1)假手術(shù)組(n=6):開胸，只穿線不結(jié)扎冠狀動脈;(2)IR組(n=10):開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支35 min，再灌注120 min，建立IR損傷模型;(3)川芎嗪低劑量組(TMP-L組，n=10):結(jié)扎前降支前5 min靜脈給予川芎嗪5 mg·kg－1，余同IR組;(4)川芎嗪中劑量組(TMP-M組，n=10):川芎嗪10 mg·kg－1，余同TMP-L組;(5)川芎嗪高劑量組(TMP-H 組，n=10):川芎嗪30 mg·kg－1，余同 TMP-L組。(6)川芎嗪+渥曼青霉素組(TMP+Wort組，n=10):缺血前5 min靜脈給予川芎嗪10 mg·kg－1，再灌前15 min 給予 PI3K 抑制劑渥曼青霉素15 μg·kg－1，余同IR組。

1．4．2 在體大鼠IR模型的建立和標(biāo)本采集 氯胺酮(150 mg·kg－1)腹腔注射麻醉，同時給予肝素(500 IU·kg－1)，仰臥位固定，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部正中切口氣管切開接小動物呼吸機機械通氣(潮氣量8 ml·kg－1，頻率60 次·min－1)。胸骨左緣3-4 肋間開胸，暴露心臟，打開心包，于左心耳與肺動脈圓錐之間左心耳下方3 mm處前降支貫穿6-0無損傷縫線，結(jié)扎前降支。結(jié)扎后心電圖Ⅱ?qū)?lián)提示J點明顯抬高，QRS波增寬以及結(jié)扎線以下左室前壁出現(xiàn)紫紺為結(jié)扎成功。持續(xù)缺血35 min后剪斷結(jié)扎線再灌注120 min。抽取大鼠右房血，3 000 r·min－1離心 5 min，留取上清檢測心肌酶。每組4只行左室心肌梗死面積測定，余留取左室缺血區(qū)心肌約150 mg，快速液氮冷凍，隨后移入－80℃冰箱凍存待檢。

1．4．3 心肌梗死面積的測定(伊文藍(lán)/TTC雙染色法) 在120 min再灌注結(jié)束時于原結(jié)扎點重新結(jié)扎前降支，尾靜脈注入2%伊文藍(lán)2 ml，心外膜藍(lán)染后獲取心臟，－20℃冰凍30 min，將心臟從心尖至心底橫向均勻切片，生理鹽水沖洗干凈，將心肌片放在1%TTC磷酸鹽緩沖液中，37℃孵化20 min染色，此時藍(lán)色為非缺血區(qū)心肌，灰白色為梗死心肌，磚紅色和灰白色為缺血區(qū)心肌。10%甲醛中固定過夜，數(shù)碼相機拍照，Image J繪圖軟件(美國NIH)測定左室梗死面積，梗死心肌范圍用梗死面積/缺血面積百分比表示。

1．4．4 SOD活性和MDA含量的測定 再灌注結(jié)束后，將心臟組織制備心肌勻漿上清液。按試劑盒要求，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，硫代巴比妥酸(TBA)顯色法測定MDA含量。

1．4．5 Western blotting 測定心肌組織中磷酸化 Akt、Akt、磷酸化eNOS和eNOS含量 應(yīng)用裂解液(含蛋白酶和磷酸酶抑制劑)提取心肌標(biāo)本總蛋白，考馬斯亮藍(lán)測定蛋白濃度。加樣總蛋白40 μg，以上樣緩沖液等體積稀釋，室溫下聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，室溫下脫脂奶粉緩沖液封閉，將PVDF膜用相應(yīng)一抗(磷酸化 Akt、Akt、磷酸化 eNOS、eNOS，1∶1 000稀釋)封閉，4℃過夜。加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000稀釋)封閉液中，室溫孵育2 h，行發(fā)光檢查并曝光分析，采用Bio-Rad公司的Gel Doc2000凝膠圖像專用軟件分析目標(biāo)條帶的積分吸光度值(IA=平均吸光度×面積)，分別以磷酸化Akt/Akt、磷酸化 eNOS/eNOS值反映 Akt、eNOS的相對活化水平。

1． 5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，應(yīng)用SPSS 13．0軟件進(jìn)行分析。各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2． 1 心肌酶結(jié)果

再灌注結(jié)束時，IR組血清CK-MB、LDH含量分別為(7 355．8 ±870．5)U·L－1和(1 667．4 ±147．8)U·L－1。川芎嗪各組CK-MB及LDH均低于IR組(均P＜0．05)，加用渥曼青霉素后，大鼠血清 CK-MB及LDH水平明顯增高(TMP+Wort組與TMP-M組相比較，P ＜0．05)，見表1。

表1 各組大鼠心肌損傷標(biāo)志物及氧化應(yīng)激水平(n=6，ˉx±s)Tab 1 The levels of enzymatic dynamics and oxidative stress of myocardium(n=6，)

表1 各組大鼠心肌損傷標(biāo)志物及氧化應(yīng)激水平(n=6，ˉx±s)Tab 1 The levels of enzymatic dynamics and oxidative stress of myocardium(n=6，)

與 IR 組比較，a P ＜0．05;與 TMP-M 組比較，b P ＜0．05

(U·mg－1)5．9a 4．3b 4．8 3．2a TMP-H 組 832．6 ±158．2a 4 702．0 ±796．3ab 0．331 ±0．023a 51．2 ±6．4a TMP+Wort組 1 289．2 ±103．9ab 7 215．6 ±530．0b 0．458 ±0．061a 48．4 ±3．5a

2． 2 心肌梗死面積測定結(jié)果

假手術(shù)組未見明顯缺血及梗死區(qū)，IR組大鼠心肌梗死面積為(50．4±4．6)%;中、高劑量川芎嗪預(yù)處理能減少心肌梗死面積［分別為(38．7±4．5)%和(36．3±4．3)%，與(50．4 ±4．6)% 相比較，均 P ＜ 0．05］;TMP-L組和TMP+Wort組大鼠心肌梗死面積分別為(46．9 ±3．1)%和(49．8 ±4．7)% ，與 IR 組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。

2． 3 各組心肌SOD活性、MDA含量

川芎嗪中、高劑量組與IR組相比，心肌SOD活性增加，MDA含量降低(P＜0．05)，川芎嗪低劑量組與IR組的SOD活性無明顯差異(P＞0．05)，見表1。

2． 4 各組大鼠心肌組織中磷酸化 Akt和磷酸化eNOS的蛋白表達(dá)結(jié)果

與IR組相比，川芎嗪中、高劑量組磷酸化Akt蛋白表達(dá)明顯增高［分別為1．61 ±0．18、1．65 ±0．18，與0．79±0．10(IR 組)相比較，均 P ＜0．05］，川芎嗪各組的磷酸化eNOS蛋白表達(dá)亦明顯增高［低、中、高組分別為 1．69 ±0．41、1．87 ±0．33、3．21 ±0．62，與0．94±0．22(IR 組)相比較，均 P ＜0．05］。渥曼青霉素能顯著抑制TMP所致的Akt和eNOS磷酸化(TMP+Wort組的磷酸化 Akt為 0．54 ±0．15，磷酸化eNOS為0．53±0．14，與 IR 組相比較，均 P ＞0．05)。見圖1。

圖1 心肌組織中磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化eNOS(p-eNOS)的蛋白表達(dá)結(jié)果Fig 1 Western blotting analysis of Akt and eNOS phosphorylation in rat cardiac tissue

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷仍是目前亟待解決的問題［1］。缺血再灌注時心肌缺血首先可導(dǎo)致心肌酶漏出、收縮偶聯(lián)障礙，進(jìn)一步則可導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞損傷和死亡。CK-MB是臨床診斷急性心肌梗死應(yīng)用最廣泛的酶，由于CK-MB主要存在于心肌內(nèi)，對心肌壞死的檢出較為特異，是心肌損傷的特異和敏感指標(biāo)，對判斷心肌梗死的擴(kuò)展、早期心肌梗死、估計心肌梗死的范圍等有重要意義。本研究結(jié)果表明，在體大鼠缺血再灌注損傷模型中，川芎嗪組大鼠心肌梗死面積、心肌CK-MB和LDH水平低于IR組，中劑量及高劑量組尤為明顯，說明川芎嗪可以減輕心肌細(xì)胞膜的損傷，降低心肌酶的釋放，減少心肌梗死面積。

氧自由基生成是心肌再灌注損傷的主要病理機制之一，再灌注過程中大量氧自由基和活性氧的產(chǎn)生可以直接損傷心肌細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能改變，引起細(xì)胞損傷與死亡［3］。SOD是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，是內(nèi)源性氧自由基清除劑，可清除生物體內(nèi)在利用氧過程中產(chǎn)生的超氧離子，其值間接反映機體清除氧自由基的能力。MDA是生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，能較好反映組織脂質(zhì)過氧化程度，是衡量氧自由基對細(xì)胞損害的標(biāo)志之一［4］。既往研究表明，在腦缺血再灌注損傷［5-6］及腎小管［7］缺血再灌注損傷模型中，川芎嗪均有抗氧化作用。在本實驗中，與IR組相比，川芎嗪中、高劑量組SOD活性增加而MDA含量降低，表明川芎嗪能有效減輕氧化應(yīng)激水平，清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能。這與文獻(xiàn)報道［8-10］一致。上述結(jié)果分別從酶學(xué)、宏觀病理、氧化應(yīng)激指標(biāo)等方面說明川芎嗪對IR損傷心肌有保護(hù)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，低劑量川芎嗪(5 mg·kg－1)大鼠心肌梗死面積較IR組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而中、高劑量川芎嗪(分別為10 mg·kg－1和30 mg·kg－1)預(yù)處理能顯著減少心肌梗死面積，中、高劑量川芎嗪組氧化指標(biāo)較低劑量組也有改善，提示川芎嗪對心肌IR損傷的保護(hù)作用與劑量相關(guān)。

PI3K是生長因子超家族信號傳導(dǎo)過程中的重要分子，可被多種細(xì)胞因子和理化因素激活。PI3K下游有多種效應(yīng)分子，Akt處于這一通路的中心環(huán)節(jié)，是PI3K下游直接和最主要的靶酶。Akt通路主要負(fù)責(zé)由PI3K始動的生物信息的傳導(dǎo)，在細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞生長凋亡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，降低缺血再灌注損傷的發(fā)病率及死亡率［11-12］。PI3K/Akt是近年來研究較多的信號通路，是再灌注挽救激酶信號通路的重要組成部分［3］。在再灌注初期，各種心肌保護(hù)手段能主動募集PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。多項研究表明，缺血預(yù)適應(yīng)和缺血后處理等機械干預(yù)和藥物干預(yù)(如他汀、腺苷、心房鈉尿肽等)均能在再灌時激活PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞存活和縮小梗死面積［13］。本研究表明，川芎嗪中、高劑量組上調(diào)了磷酸化Akt的表達(dá)，但PI3K抑制劑渥曼青霉素能消除TMP所致的Akt的磷酸化，提示TMP激活了PI3K/Akt信號通路。

PI3K/Akt信號通路涉及多種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)和效應(yīng)蛋白。其中，eNOS是PI3K/Akt信號通路的下游靶點之一［14］。Akt的活化使eNOS的表達(dá)上調(diào)，eNOS絲氨酸1177位點的磷酸化導(dǎo)致其活性增加，最終通過減少線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，改善線粒體能量的生成，保持線粒體外膜的穩(wěn)定性，從而減少凋亡和保存心?。?5］。近年研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能逆轉(zhuǎn)高葡萄糖所致內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化eNOS的下調(diào)，增加一氧化氮含量，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞［8］。本研究中，川芎嗪各組均上調(diào)了磷酸化eNOS的表達(dá)，PI3K抑制劑渥曼青霉素能消除TMP所致的eNOS的磷酸化，表明TMP所致的eNOS的激活是通過PI3K/Akt信號通路產(chǎn)生的。而TMP+Wort組心梗面積較IR組無明顯差異，提示渥曼青霉素能減弱TMP的心肌保護(hù)作用。因此，本實驗證實，川芎嗪對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與PI3K/Akt-eNOS信號通路的激活有關(guān)，并通過依次激活下游靶目標(biāo)，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

PI3K/Akt的下游靶點還包括B細(xì)胞淋巴瘤/白細(xì)胞2(Bcl-2)家族、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、天冬氨酸蛋白酶9(caspase-9)、70 kD核糖體蛋白s6激酶(p70S6K)等［16］，這些靶酶是否參與川芎嗪對在體大鼠心肌再灌注損傷的保護(hù)作用，尚待進(jìn)一步研究。

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