張文泉，閆 偉

樟子松愈傷誘導(dǎo)及植株再生的初步研究

張文泉，閆 偉

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019）

以樟子松成熟胚為外植體，研究不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)樟子松愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響，并獲得了完整的再生植株。結(jié)果表明：誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基組合為MS+1.5 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA，愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基組合為MS+ 0.2 mg/L IAA +1.5 mg/L 6-BA，樟子松不定芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的適宜基本培養(yǎng)基為1/2MS＋0.1%活性炭，誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基組合為1/4MS+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA。

樟子松；組織培養(yǎng)；植株再生

樟子松Pinus sylvestris var. mongolica Litv.是松科松屬高大常綠喬木樹(shù)種，是歐洲赤松的一個(gè)地理變種，其材質(zhì)良好，防風(fēng)固沙作用顯著，具有抗寒、抗旱、耐貧瘠、適應(yīng)性強(qiáng)且較速生等特點(diǎn)，是我國(guó)北方主要造林和防風(fēng)固沙樹(shù)種。但樟子松結(jié)實(shí)間隔期長(zhǎng)，籽粒空癟率高，種子不能很快滿足生產(chǎn)上的需要[1]，組織培養(yǎng)作為一項(xiàng)生物技術(shù)為快速繁殖松屬樹(shù)種提供了一條有效的途徑。當(dāng)前國(guó)內(nèi)對(duì)樟子松離體培養(yǎng)雖有研究，但至今未有對(duì)其愈傷誘導(dǎo)途徑的報(bào)道，因此，對(duì)樟子松愈傷誘導(dǎo)及植株再生研究具有一定的理論和實(shí)踐意義[2-8]。本研究以樟子松成熟胚為外植體, 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織后, 愈傷組織分化獲得到再生植株, 建立了植株再生體系。

1 材料與方法

供試材料種子采自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市鄂溫克族自治旗紅花爾基樟子松國(guó)家森林公園。

1.1 供試外植體

供試材料為樟子松成熟胚。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料消毒

精選的種子用 30℃左右溫水浸泡 24 h，0.5 %KMnO4溶液消毒 10～20 min，在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)ネ鈿?，無(wú)菌水沖洗干凈后，用75%酒精表面消毒 1 min，無(wú)菌水沖洗 2 次，之后再用 10%的NaClO 溶液消毒 20 min，無(wú)菌水沖洗 5～6 次，用無(wú)菌濾紙吸去表面水分。于無(wú)菌條件下用細(xì)鑷子剝?nèi)ヅ呷?取出成熟種胚用于接種。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

將成熟種胚接種到以 1/2MS 為基本培養(yǎng)基，附加 20 g/L 的蔗糖、8 g /L 的瓊脂、不同質(zhì)量濃度的2,4-D(0.5,1.5,2.5 mg/L)與 6-BA(0.5 ,1.0 ,1.5 mg/L)組合，NAA（0.5 ,1.0 mg/L）與 6-BA(0.5 ,1.0 ,1.5 mg/L)組合，pH值調(diào)至 5.8 的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。黑暗處理 15 d 后，轉(zhuǎn)移至光強(qiáng)為1 500 Lx 的光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為16 h/d，培養(yǎng)溫度為 (25±1) ℃。每處理接種 32個(gè)外植體。20 d 后觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3 愈傷組織的分化

將獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)移至 1/2MS 為基本培養(yǎng)基，附加 20 g/L 的蔗糖、8 g /L的瓊脂、不同質(zhì)量濃度的 6-BA(0.5,1.0,1.5,2.0 mg/L)與 IBA（0.2,0.5 mg/L）組合培養(yǎng)基上，pH 值調(diào)至 5.8，誘導(dǎo)不定芽，35 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化情況及平均芽數(shù)。

不定芽誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生不定芽的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織數(shù)總數(shù))×100 %;

平均不定芽數(shù)＝不定芽總數(shù)/被誘導(dǎo)的胚數(shù)。

1.2.4 芽的伸長(zhǎng)

將獲得的不定芽接入伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，芽伸長(zhǎng)采用 1/2MS 為基本培養(yǎng)基，附加20 g/L 的蔗糖，8/L 的瓊脂，添加不同質(zhì)量濃度的活性炭 (0，0.03，0.05 ，0.1，0.15 ，0.2 mg/L)的培養(yǎng)基，pH值調(diào)至 5.8，不加任何激素。選擇合適的活性炭質(zhì)量濃度。

1.2.5 不定根的誘導(dǎo)

將高 1 cm 左右的芽接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行根的誘導(dǎo)。生根培養(yǎng)基以1/2MS、1/4MS 為基本培養(yǎng)基, 附加 20 g/L 的蔗糖、8 g/L 的瓊脂，添加不同質(zhì)量濃度的萘乙酸(NAA)和吲哚乙酸(IBA),40 d 后統(tǒng)計(jì)生根情況。

不定根誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生不定根的芽數(shù)/接種芽總數(shù))×100 %。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)和外植體選擇

以樟子松成熟胚作為外植體，7 d后成熟胚均有愈傷組織產(chǎn)生，成熟胚膨大,葉面卷曲,開(kāi)始出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的愈傷組織。樟子松成熟胚形成的愈傷組織從形態(tài)上可分為兩種類型：一種是淡黃色、光滑致密、球狀突起的愈傷組織，后轉(zhuǎn)為綠白色（見(jiàn)圖1）；另一種是形成了不規(guī)則的黃白色，質(zhì)地較為疏松的愈傷組織（見(jiàn)圖2）。從愈傷組織誘導(dǎo)正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析 (見(jiàn)表1) 表明, 愈傷誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)素2，4-D與NAA比較，2，4-D較優(yōu)于NAA。從表1可以看出,不同實(shí)驗(yàn)中的誘導(dǎo)結(jié)果有很大差異,其中水平組合為第2組實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率為91.6 %。

本試驗(yàn)篩選樟子松愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+ 1.5 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA。

圖1 成熟胚形成的愈傷1Fig.1 Foraminate callus in mature embryo 1

圖2 成熟胚形成的愈傷2Fig.2 Foraminate callus in mature embryo 2

2.2 愈傷組織的分化

愈傷組織接入分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，光照培養(yǎng)15 d左右，已經(jīng)出現(xiàn)了分化的跡象。繼續(xù)培養(yǎng)20 d后，部分愈傷組織上形成綠色的芽點(diǎn)，芽點(diǎn)進(jìn)一步發(fā)育35 d左右，形成不定芽或芽叢。每塊愈傷組織上不定芽的數(shù)量多少不等，有的僅形成1個(gè)不定芽，最多的可達(dá)7個(gè)（見(jiàn)圖3）。其中不同質(zhì)量濃度的激素對(duì)愈傷組織的分化存在較大差異（見(jiàn)表2），當(dāng)6-BA為1.5 mg/L、IAA為0.2 mg/L時(shí)，出芽率最高。因此，本試驗(yàn)中樟子松愈傷組織分化的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L +IAA 0.2 mg/L。

表1 外植體在不同激素質(zhì)量濃度的 MS 培養(yǎng)基上愈傷形成率?Table 1 Effects of different hormone and different concentration of hormone in MS medium on inductivity of callus

圖3 形成多個(gè)不定芽Fig.3 Adventitious bud in vitro shoot

表2 不同質(zhì)量濃度的激素組合對(duì)愈傷組織分化的影響Table 2 Effects of different hormone and different concentration on callus differentiation

2.3 芽的伸長(zhǎng)

大量組織培養(yǎng)試驗(yàn)證明活性炭對(duì)芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，本試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖4）表明，活性炭的加入對(duì)樟子松不定芽的生長(zhǎng)與伸長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，不同濃度活性炭的加入對(duì)芽伸長(zhǎng)存在顯著性差異，當(dāng)加入的活性炭濃度為0.1%時(shí)，最有利于叢生芽苗的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，當(dāng)活性炭濃度高于這個(gè)值后芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)開(kāi)始受到抑制，這可能是由于活性炭在吸附有害物質(zhì)的同時(shí)也吸附了礦質(zhì)元素。因此，在樟子松叢生芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中，加入0.1%的活性炭較為適宜（見(jiàn)圖5）。

圖4 芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)Fig.4 Elongation growth of bud

圖5 活性炭對(duì)不定芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響Fig.5 Influence of activated charcoal on growth of adventitious buds

2.4 不定根的誘導(dǎo)

將高1 cm左右的芽接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行根的誘導(dǎo)，1周后觀察到部分無(wú)根幼苗莖基部有愈傷組織產(chǎn)生，隨后形成不定根，2周后即可獲得完整的再生植株(見(jiàn)圖6，7)，4周時(shí)，根長(zhǎng)可達(dá)1.5 cm左右。不定根誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3）表明：培養(yǎng)基中大量元素質(zhì)量濃度對(duì)樟子松芽的生根具一定的影響,降低培養(yǎng)基中的大量元素質(zhì)量濃度有利于樟子松不定芽的生根,1/4MS培養(yǎng)基對(duì)樟子松不定芽生根最為有效,在以1/4MS為培養(yǎng)基且不加任何激素的情況下,培養(yǎng)一段時(shí)間偶爾有不定根產(chǎn)生。培養(yǎng)基中單獨(dú)加入生長(zhǎng)素可明顯提高不定芽的生根率，NAA的效果比IBA好,在含有NAA的1/4MS生根培養(yǎng)基中同時(shí)加入低質(zhì)量濃度的IBA對(duì)樟子松不定根的誘導(dǎo)有明顯的促進(jìn)作用，生根率達(dá)60 %。

圖6 根系誘導(dǎo)Fig.6 Roots induced

圖7 完整的再生植株Fig.7 Complete regeneration plant

表3 不同培養(yǎng)基和 NAA、IBA 對(duì)不定根誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different media with different NAA and IBA on adventitious root inductions

3 討 論

植物形成愈傷組織后，再分化形成完整植株,在離體植物快繁中是普遍存在的現(xiàn)象[9-11]。關(guān)于樟子松通過(guò)此途徑獲得再生植株的研究，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道, 本試驗(yàn)研究表明，利用樟子松成熟胚作為外植體，通過(guò)脫分化形成愈傷組織，再分化形成不定芽而產(chǎn)生再生植株。

其中培養(yǎng)基配方正確與否直接影響著外植體的脫分化與再分化[12]，特別是各種誘導(dǎo)培養(yǎng)基和8 種不同的愈傷組織分化培養(yǎng)基。激素的調(diào)配也尤為重要，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了15種不同的誘導(dǎo)愈傷組織的激素組合，其中以 2,4-D 1.5 mg/L 和 6-BA 0.5 mg/L 培養(yǎng)基的愈傷組織形成率較高, 而且在愈傷誘導(dǎo)過(guò)程中，2,4-D 對(duì)樟子松的影響大于 NAA，6-BA 為 1.0 mg/L、IAA 為 0.2 mg/L 時(shí)，出芽率最高，且與其它培養(yǎng)基存在顯著差異，明顯表現(xiàn)出激素組合的優(yōu)勢(shì)。

為了使增殖后的芽苗進(jìn)一步伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，可利用去掉植物激素，降低礦質(zhì)鹽、維生素及蔗糖等方法[13]，附加吸附物質(zhì)如活性炭，對(duì)芽的生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用[14]。

本研究表明，在以 1/2MS 為基本培養(yǎng)基，去掉植物激素的情況下，附加 0.1%的活性炭對(duì)樟子松不定芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)起到良好的促進(jìn)作用，這也許與活性炭在一定程度上吸附了不定芽在生長(zhǎng)過(guò)程中代謝出的有害物質(zhì)有關(guān)，與齊力旺等[15]對(duì)油松封頂芽的組織培養(yǎng)，鄭均寶等[16]對(duì)油松離體胚子葉的組織分化和無(wú)根試管苗，闕國(guó)寧等[17]對(duì)火炬松、濕地松、晚松組培繁殖的研究結(jié)果一致。

針葉樹(shù)組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)生根往往比較困難，生根率低嚴(yán)重制約著針葉樹(shù)的離體快速繁殖。促進(jìn)針葉樹(shù)生根的方法通常有：降低培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽的質(zhì)量濃度、降低蔗糖的質(zhì)量濃度、加入不同種類和配比的激素、培養(yǎng)基中加入活性炭、誘導(dǎo)前期用激素進(jìn)行刺激、試管外生根等[18-24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基、生長(zhǎng)素種類和質(zhì)量濃度等對(duì)樟子松不定芽生根有較大影響。培養(yǎng)基中大量元素含量減半（由1/2MS降到1/4MS）有利于樟子松不定根的誘導(dǎo)，1/4 MS培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)樟子松不定芽生根效果較好，在不含生長(zhǎng)素的情況下偶爾有不定根產(chǎn)生，這與Thorpe總結(jié)針葉樹(shù)中再生植株形成過(guò)程中芽生根的結(jié)論一致。

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Preliminary study on calliferous induction and plant regeneration of Pinus sylvestris var. mongolica Litv

ZHANG Wen-quan, YAN Wei
(Forestry College, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010019, Inner Mongolia Autonomous Region, China)

The effects of various combination of growth regulating agents on the callus induction and differentiation of mature embryo of Pinus sylvestris var. mongolica Litv were studied, and complete regeneration plant was established. The results indicate that the optimum medium for callus induction from leaves was MS+ 1.5 mg/L 2,4-D+0. 5 mg/L 6-BA; the optimum medium for callus differentiation was MS+ 0.2 mg/L IAA + 1.5 mg/L 6-BA; the best medium for increasing the height of cluster buds was 1/2MS+0.1% activated carbon and the adventitious root was induced on 1/4 MS++0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA.

Pinus sylvestris var. mongolica Litv；tissue culture；plant regeneration

S791.253; Q943.1

A

1673-923X(2012)11-0037-05

2012-05-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31060111）

張文泉（1984-），男，湖南婁底人，博士研究生，主要從事林木菌根生物技術(shù)方面的研究

閆 偉（1959-），男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事林木菌根生物技術(shù)方面的研究；E-mail：weiyan @imau.edu.cn

[本文編校：謝榮秀]