鄧 勛，宋瑞清，宋小雙，尹大川

高效木霉菌株對(duì)樟子松枯梢病的抑菌機(jī)理

鄧 勛1，宋瑞清2，宋小雙1，尹大川2

（1.黑龍江省林科院 森林保護(hù)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

采用菌株對(duì)峙培養(yǎng)法和木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌株的生長(zhǎng)抑制法，從28個(gè)木霉菌株中篩選對(duì)樟子松枯梢病菌抑制效果顯著的菌株；比較不同有機(jī)溶劑對(duì)木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中抑菌活性成分的萃取效果，獲得對(duì)病原菌抑制顯著的提取物，研究了高效提取物對(duì)樟子松枯梢病菌保護(hù)酶活性的影響；分別制備孢子菌劑和液體菌劑對(duì)樟子松枯梢病進(jìn)行了野外防治試驗(yàn)。結(jié)果表明：在對(duì)峙培養(yǎng)中，引進(jìn)菌株T-43對(duì)樟子松枯梢病菌的抑制效果63.28%，相對(duì)抑制效果為6.05，木霉完全覆蓋病原菌；木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌株的生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中，T-43菌株發(fā)酵液及乙酸乙酯提取物對(duì)病原菌的抑制率分別為92.94%和90.58%，病原菌菌絲生長(zhǎng)稀疏或被完全抑制生長(zhǎng)；菌株T-43發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對(duì)病原菌的主要保護(hù)酶SOD、POD、CAT和PPO影響作用顯著，提取物通過(guò)破壞病原菌的防護(hù)系統(tǒng)，抑制病原菌生長(zhǎng)；在T-43對(duì)樟子松枯梢病的野外防治試驗(yàn)中，引進(jìn)菌株T-43的防治效果明顯好于國(guó)內(nèi)高效菌株T-C14和商品化的木霉分生孢子可濕性粉劑，其中用發(fā)酵液制備的液體菌劑10倍液防治效果好于分生孢子菌劑，2011年得病害控制效果達(dá)到76.67%。連續(xù)的防治可以有效的控制病害的發(fā)生。

木霉；樟子松枯梢病；抑菌機(jī)理；生物防治

樟子松Pinus sylvestris var. mongolica是我國(guó)北方主要造林樹(shù)種，在生態(tài)建設(shè)、環(huán)境修復(fù)方面發(fā)揮重要作用[1]。樟子松枯梢病是由松球殼菌Sphaeropsis sapinea（Fr．）Dyko et Sutton引起的一種發(fā)病普遍、危害性大的世界性的傳染性病害?？萆也儆诩闹髦鲗?dǎo)性病害，對(duì)該類病害的控制應(yīng)以提高寄主抗性及降低病原菌種群數(shù)量為主要方向[2]。

木霉菌Trichoderma spp.是自然界中資源豐富的拮抗微生物，具有抗菌譜廣、適應(yīng)性強(qiáng)和多機(jī)制性的特點(diǎn)。首先, 木霉菌競(jìng)爭(zhēng)作用強(qiáng)，木霉菌還能產(chǎn)生揮發(fā)性或非揮發(fā)性的抗菌類物質(zhì)，對(duì)多種病原菌有抑制作用。此外，它還具有重寄生作用，通過(guò)胞外酶破壞病原菌細(xì)胞壁，削弱病原菌的生長(zhǎng)勢(shì), 甚至殺死病原菌[3]，目前世界范圍內(nèi)已有以木霉為主要成分的生物殺菌劑，在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用[4]。同時(shí)，很多木霉種類對(duì)植物還具有促生抗逆的作用，通過(guò)定殖和次生代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物生長(zhǎng)[5]，提高植物抗病能力。

篩選開(kāi)發(fā)有效控制樟子松枯梢病的木霉菌株及其制劑產(chǎn)品，對(duì)保持樟子松林微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定、有效控制枯梢病的發(fā)生、減少化學(xué)農(nóng)藥的使用具有重要意義。本研究利用篩選獲得的高效木霉菌株T-43制備不同劑型菌劑進(jìn)行了野外應(yīng)用研究，為進(jìn)一步研究木霉對(duì)松枯梢病菌的抑菌機(jī)理并開(kāi)發(fā)穩(wěn)定的生物菌劑打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

（1）木霉菌株： 28株木霉。國(guó)外引進(jìn)7株，課題組在國(guó)內(nèi)分離21株。上述菌株保存于東北林業(yè)大學(xué)森林微生物研究中心，菌株具體信息見(jiàn)表2。

（2）病原菌株：樟子松枯梢病菌—松球殼菌Sphaeropsis sapinea（Fr．）Dyko et Sutton，自遼寧省防風(fēng)固沙研究所章古臺(tái)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)樟子松人工林內(nèi)感病樟子松上分離，保藏于東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林微生物研究中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木霉菌株對(duì)病原菌株的拮抗效果

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[6]。以單獨(dú)接種病原菌株和木霉菌株的平板作為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每8 h測(cè)量一次菌落半徑。計(jì)算各菌株生長(zhǎng)被抑制率、木霉菌株相對(duì)抑制效果、木霉菌株生長(zhǎng)速度，統(tǒng)計(jì)競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)。觀察是否有拮抗線產(chǎn)生， 對(duì)峙培養(yǎng)中競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1[7]。

表1 菌株對(duì)峙培養(yǎng)中競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Grading standards for competition coefficients of Trichoderma strains in co-culture

被抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑-對(duì)峙培養(yǎng)菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100% 。

相對(duì)抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率。

1.2.2 木霉菌株非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制效果

非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的制備：切取培養(yǎng)好的木霉菌餅3片接種到300 mL PD培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)（25℃，150 r/min）7 d，過(guò)濾菌絲，取濾液分別與正己烷、乙酸乙酯和正丁醇按1:3體積比，靜置萃取2 d后分液去除無(wú)機(jī)相，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)相。用濾液1/10體積的5% Tween80溶液溶解萃取物，同時(shí)將未萃取的發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到原體積的1/10，備用。

抑菌活性測(cè)定：采用菌絲生長(zhǎng)抑制法[8]。將上述非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物添加到PDA培養(yǎng)基中，搖勻，使非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物終濃度達(dá)到20%。倒平板，接入病原菌，以不添加代謝產(chǎn)物的PDA平板培養(yǎng)作為對(duì)照，25℃恒溫培養(yǎng)5 d。采用十字交叉法測(cè)量病原菌的菌落直徑，計(jì)算各木霉菌株非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制率，每處理3次重復(fù)。

1.2.3 木霉菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌保護(hù)酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）是生物體中最重要的抗氧化酶，能夠催化生物氧化過(guò)程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基為O2和H2O2，保持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。過(guò)氧化氫酶（CAT）是一種以鐵卟啉為輔基的酶，能清除SOD的歧化產(chǎn)物H2O2為O2和H2O，避免某些具有生理功能的蛋白質(zhì)和巰基酶被氧化，喪失活性，對(duì)生物膜造成損傷[9]。過(guò)氧化物酶（POD）是清除H2O2與許多有機(jī)氫過(guò)氧化物的抗氧化酶之一，它對(duì)H2O2非常專一。多酚氧化酶（PPO）也是植物重要的保護(hù)酶之一[10]。本研究擬從提取物對(duì)病原菌保護(hù)酶系統(tǒng)中超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）活性的影響角度，探討木霉菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌機(jī)理。參考冀瑞卿[11]、計(jì)紅芳[9]的方法。將PD培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d的病原菌菌絲用無(wú)菌水洗凈后置于20 mL含10%提取物的無(wú)菌水中，靜置。分別于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h后取樣，測(cè)定菌絲保護(hù)酶活性，以10%吐溫80處理為空白對(duì)照。SOD、POD、CAT、PPO酶活測(cè)定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。

1.2.4 高效木霉菌株對(duì)樟子松枯梢病控制的野外應(yīng)用研究

（1）試驗(yàn)地概況：樟子松枯梢病野外防治基地設(shè)在遼寧省固沙所章古臺(tái)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)的樟子松林內(nèi)。樟子松標(biāo)準(zhǔn)地建立于1985年，林齡25年，胸徑15 cm，樹(shù)高15 m，枯梢病發(fā)病率70%以上，適合進(jìn)行生物防治。

（2）野外應(yīng)用時(shí)間：2010、2011年連續(xù)兩年進(jìn)行防治。2010年以濃度梯度篩選試驗(yàn)為主，2011年以對(duì)比試驗(yàn)為主。對(duì)樟子松枯梢病的防治采用病害控制方式，病害控制時(shí)間選擇在樹(shù)木發(fā)病后。

（3）菌劑制備：根據(jù)高效菌株篩選結(jié)果，采用國(guó)內(nèi)菌株T-C14和引進(jìn)菌株T-43制備菌劑，進(jìn)行野外應(yīng)用研究。菌劑采用孢子粉劑和液體菌劑兩種。

孢子粉劑的制作：將木霉孢子液加入菌糠培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)7 d后，用滅菌玻璃棒攪拌培養(yǎng)料，促進(jìn)產(chǎn)孢。3 d后收獲培養(yǎng)料，風(fēng)干，過(guò)200目篩，制備孢子粉劑。其中菌株T-43孢子粉劑濃度為3.2×107g，菌株T-C14孢子粉劑濃度為1.7×107g，分裝后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

液體菌劑的制作：將木霉孢子液接種于300 mL PD培養(yǎng)基中，25℃恒溫震蕩培養(yǎng)7 d，過(guò)濾去除菌絲，將發(fā)酵液與乙酸乙酯按1:3的比例（V/V）進(jìn)行萃取，2 d后分液去除無(wú)機(jī)相，將有機(jī)相進(jìn)行減壓濃縮，后用5%的Tween80溶解制備液體菌劑。

（4）菌劑施用方法：2010濃度梯度試驗(yàn)：設(shè)定不同濃度梯度菌劑進(jìn)行野外應(yīng)用研究。菌劑為孢子粉劑和液體菌劑。濃度設(shè)定見(jiàn)表4每個(gè)濃度梯度防治20株樹(shù)，設(shè)3個(gè)重復(fù)，設(shè)定空白對(duì)照。采用樹(shù)冠噴霧的方式施藥。用藥時(shí)間為2010年7月10日、7月20日和7月30日。2010年9月調(diào)查病情指數(shù)，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析，篩選最佳濃度梯度。

2011對(duì)比試驗(yàn)：以T-43為目標(biāo)菌株制備孢子粉劑和液體菌劑進(jìn)行野外應(yīng)用研究。同時(shí)選用商品化的木霉分生孢子可濕性粉劑作為對(duì)照，濃度設(shè)定見(jiàn)表5。每個(gè)處理20株樹(shù)，設(shè)3個(gè)重復(fù)。菌劑施用時(shí)間為2011年7月10日、7月20日和7月30日。2011年9月調(diào)查病情指數(shù)，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析，評(píng)價(jià)防治效果。

病害損失估計(jì)采用分級(jí)計(jì)數(shù)法，以病情指數(shù)表示發(fā)病程度，病情指數(shù)計(jì)算：

病情指數(shù)=[Σ（病級(jí)株數(shù)×代表數(shù)值）/株數(shù)總和×最重一級(jí)代表數(shù)值] ×100 。

防治效果=（對(duì)照區(qū)感病指數(shù)-防治區(qū)感病指數(shù)）/對(duì)照區(qū)感病指數(shù)×100% 。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌株對(duì)病原菌的拮抗效果用

各木霉菌株對(duì)病原菌株均有不同程度的抑制效果（表2）。對(duì)峙培養(yǎng)48 h后， 菌株T-C14、T-C33、T-43、T-19和T-28對(duì)病原菌生長(zhǎng)抑制率均在50%左右，菌株生長(zhǎng)速度較快，競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)高，在同病原菌對(duì)峙培養(yǎng)中，能迅速占領(lǐng)生態(tài)位，最終覆蓋病原菌，病原菌在木霉菌株的拮抗下幾乎停止生長(zhǎng)。與木霉菌株接觸的病原菌株，其氣生菌絲開(kāi)始逐漸稀疏甚至萎蔫。菌株T-19、T-C33能越過(guò)病原菌生長(zhǎng)區(qū)域并逐漸將病原菌菌落覆蓋，菌株T-43、T-28和T-C14與病原菌之間形成明顯的拮抗線，并最終覆蓋病原菌。通過(guò)比較，引進(jìn)木霉菌株優(yōu)勢(shì)明顯，菌株T-28、T-43對(duì)病原菌的相對(duì)抑制效果達(dá)到6以上，在抑制病原菌生長(zhǎng)的同時(shí)，自身的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有受到抑制，而是直接覆蓋病原菌，競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)最高。

表2 木霉菌株與樟子松枯梢病菌的對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果Table 2 Antagonistic culture of Trichoderma strains and Sphaeropsis sapinea

圖1 菌株T-43（1）、T-28（2）與樟子松枯梢病菌的對(duì)峙培養(yǎng)效果Fig.1 Antagonistic culture effects of Trichoderma strains and pathogen (1, T-43, 2, T-28)

2.2 非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制效果

各菌株的各非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物及發(fā)酵原液對(duì)病原菌的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制效果（表3）。引進(jìn)菌株中T-43抑菌效果最好，其原液和乙酸乙酯提取物的抑菌率均超過(guò)90%；菌株T-28原液和菌株T-13原液的抑菌率分別超過(guò)81%和65%。病原菌在平板上菌絲稀疏，生長(zhǎng)明顯變?nèi)跎踔敛簧L(zhǎng)，被完全抑制。國(guó)內(nèi)菌株中，T-C33抑菌效果最好，其原液和乙酸乙酯提取物的抑菌率均超過(guò)76%；其次為菌株T-C14，其原液和正丁醇提取物的抑菌率均超過(guò)63%。同正己烷相比，正丁醇和乙酸乙酯萃取效果更好，而真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)，乙酸乙酯沸點(diǎn)更低，同原液相比，萃取后的代謝產(chǎn)物抑菌活性更強(qiáng)。在進(jìn)一步的野外應(yīng)用中，以乙酸乙酯為萃取劑進(jìn)行大規(guī)模活性成分的提取制備。

綜合對(duì)峙培養(yǎng)和抑菌試驗(yàn)結(jié)果，選用引進(jìn)菌株T-43作為防治枯梢病生物菌劑的出發(fā)菌株，制備孢子粉劑和液體菌劑進(jìn)行野外應(yīng)用研究。以國(guó)內(nèi)高效菌株T-C14作為對(duì)照，對(duì)比國(guó)內(nèi)外菌株對(duì)樟子松枯梢病的生物防治能力，評(píng)價(jià)應(yīng)用效果。

表3 木霉菌株代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制率（%）Table 3 Inhibition rates of extracts to pathogen’s growth

圖2 菌株T-28（a）、T-43（b）非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制效果Fig. 2 Inhibition rates of Trichoderma(a T-28, b T-43) extracts on pathogen’s growth

2.3 木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑菌機(jī)理

4種保護(hù)酶對(duì)木霉菌株T-43發(fā)酵液乙酸乙酯提取物均比較敏感，在整個(gè)測(cè)試過(guò)程，都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)（圖3～圖6），四種保護(hù)酶變化趨勢(shì)基本相同，對(duì)照組酶活基本處于緩慢上升的趨勢(shì)，處理組酶活在10-12 h達(dá)到峰值，后迅速下降，48 h后酶活幾乎為零。上述結(jié)果說(shuō)明處理組菌體在提取物的逆境脅迫下，前期SOD、CAT、POD和PPO互相協(xié)調(diào)一致，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，來(lái)發(fā)揮它們對(duì)菌體的保護(hù)作用，后期由于氧自由基的增加和膜脂過(guò)氧化的加重，細(xì)胞透性增加，蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重，最終導(dǎo)致各種酶含量的降低或消失，菌體死亡。

圖3 樟子松枯梢病菌SOD酶活變化Fig.3 SOD enzyme activity changes of Sphaeropsis sapinea pathogen of Pinus sylvestris var. mongolica

圖4 樟子松枯梢病菌CAT酶活變化Fig.4 CAT enzyme activity changes of Sphaeropsis sapinea pathogen of Pinus sylvestris var. mongolica

圖5 樟子松枯梢病菌POD酶活變化Fig.5 POD enzyme activity changes of Sphaeropsis sapinea pathogen of Pinus sylvestris var. mongolica

2.4 木霉菌劑對(duì)樟子松枯梢病控制的野外應(yīng)用研究

連續(xù)兩年在樟子松枯梢病發(fā)病嚴(yán)重的遼寧省固沙所章古臺(tái)實(shí)驗(yàn)基地樟子松人工林進(jìn)行木霉菌劑野外應(yīng)用研究結(jié)果顯示，不同濃度梯度的菌劑的防治效果存在顯著差異，其中引進(jìn)菌株T43液體菌劑（10倍液）對(duì)樟子松枯梢病的控制效果超過(guò)94%，孢子粉劑（300倍液）控制效果超過(guò)68%。國(guó)內(nèi)菌株T-C14液體菌劑（10倍液）控制效果也超過(guò)78%，孢子粉劑（150倍液）控制效果超過(guò)63%，引進(jìn)菌株對(duì)樟子松枯梢病的控制能力明顯好于國(guó)內(nèi)的高效菌株（表4）。

圖6 樟子松枯梢病菌PPO酶活變化Fig.6 PPO enzyme activity changes of Sphaeropsis sapinea pathogen of Pinus sylvestris var. mongolica

2011年在確定菌劑最佳應(yīng)用濃度的基礎(chǔ)上，選擇商品化木霉分子孢子可濕性粉劑作為對(duì)比。結(jié)果表明，T-43液體菌劑10倍液防治效果達(dá)到75%以上，分生孢子粉劑效果不理想， T-43分生孢子粉劑防治效果66.67%，對(duì)照（木霉分生孢子可濕性粉劑）防治效果72%，均低于T-43液體菌劑（表5）。

表4 木霉菌劑野外應(yīng)用效果（2010年）Table 4 Field application effects of Trichoderma agent in 2010

表5 木霉菌劑野外應(yīng)用效果（2011年）Table 4 Field application effects of Trichoderma agent in 2011

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

通過(guò)木霉菌株與病原菌株平板對(duì)峙培養(yǎng)研究、木霉菌株非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑菌活性研究，高效木霉菌株對(duì)病原菌保護(hù)酶活性的影響研究以及野外應(yīng)用研究，得出以下結(jié)論：

（1）引進(jìn)菌株T-43和T-28對(duì)樟子松枯梢病菌具有顯著的拮抗作用。引進(jìn)菌株T-43發(fā)酵液原液和乙酸乙酯提取物對(duì)病原菌抑制效果顯著。

（2）引進(jìn)菌株T-43乙酸乙酯提取物顯著降低病原菌保護(hù)酶（SOD、CAT、POD和PPO）活性，使病原菌氧自由基增加、膜脂過(guò)氧化的加重、細(xì)胞透性增加、蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重，最終導(dǎo)致各種酶含量的降低或消失，菌體死亡。

（3） 菌株T-43液體菌劑10倍液對(duì)樟子松枯梢病具有顯著的控制效果。

3.2 討 論

樟子松在我國(guó)很多地區(qū)廣泛分布, 具有抗旱、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，為三北防護(hù)林工程和治沙工程建設(shè)的主要針葉造林樹(shù)種?？萆也∈且环N世界上廣泛發(fā)生的病害，該病主要發(fā)生于苗木和中老齡樹(shù)木上。樟子松枯梢病屬于寄主主導(dǎo)性病害，是多種生態(tài)因素長(zhǎng)期協(xié)同作用的結(jié)果，屬于林木生態(tài)病害。單純的化學(xué)防治對(duì)該類病害很難奏效，而且會(huì)帶來(lái)一系列環(huán)境問(wèn)題?；谖⑸鷳B(tài)調(diào)控的生物防治技術(shù)是通過(guò)人為引進(jìn)高效拮抗菌株抑制病原菌，達(dá)到保持生態(tài)系統(tǒng)平衡，控制病害發(fā)生的目的。木霉菌作為普遍存在并具有豐富資源的拮抗微生物,在植病生防中具有重要的不可替代的地位[12]。在土傳病害[13-14]、葉部病害[15-16]等的生物防治中發(fā)揮了重要的作用，并形成了多個(gè)商品化的品種，在生物農(nóng)藥中占據(jù)了重要的地位。木霉菌對(duì)病原菌的拮抗作用具有廣譜性的特點(diǎn)。但不同的種、同種的不同菌株都存在著拮抗活性的差異及拮抗對(duì)象種類上的差別。

本研究對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)外的28個(gè)木霉菌株進(jìn)行了篩選。在對(duì)峙培養(yǎng)中，菌株T-43對(duì)樟子松枯梢病菌具有極強(qiáng)的拮抗和競(jìng)爭(zhēng)作用，對(duì)峙培養(yǎng)2 d，對(duì)病原菌的抑制率達(dá)到60.17%，相對(duì)抑制效果為6.05，在抑制病原菌生長(zhǎng)的同時(shí)，自身的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有受到抑制，而是直接覆蓋病原菌。筆者其它的試驗(yàn)結(jié)果證明，菌株T-43對(duì)主要林木病原菌包括：樟子松枯梢病菌Sphaeropsis sapinea、楊樹(shù)爛皮病菌Cytospora chrysosperma、楊樹(shù)葉枯病菌Alternaria alternata、沙棘干縮病菌Fusarium sporotrichoides、苗木立枯病菌Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum、Pythium debaryanum均有明顯的拮抗作用，說(shuō)明該菌是適應(yīng)性較強(qiáng)的廣譜性拮抗菌，在病害生物防治中具有廣闊的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。高克祥對(duì)楊樹(shù)潰瘍病的高效拮抗木霉進(jìn)行了篩選，其中哈茨木霉T-88和深綠木霉T-95對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌Cytospora chrysosperma和楊樹(shù)水泡潰瘍病菌Dothiorella gregaria 的抑制率可以達(dá)到60%以上，與本文篩選的高效菌株相似。T-43同時(shí)具有重寄生作用，通過(guò)對(duì)峙菌落的顯微觀察，T-43對(duì)樟子松枯梢病菌具有明顯的重寄生作用， T-43產(chǎn)生附著胞或者鉤狀分枝吸附于病原菌的菌絲上，使病原菌菌絲斷裂死亡，該結(jié)果與Chet的觀察結(jié)果一致[17-18]。

研究證明，木霉菌的次生代謝產(chǎn)物豐富，可產(chǎn)生揮發(fā)或不揮發(fā)性的抗生素類物質(zhì)，如木霉菌素(trichodermin)、膠毒素(gliotoxin)、膠綠木霉素(glioviridin)、綠色菌素(viridin)和抗菌肽(antibiotic peptide)以及揮發(fā)性抗菌素等。該功能可以與其它的生防作用機(jī)制（競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用、胞壁降解酶等）發(fā)揮協(xié)同增效作用，達(dá)到抑制病原的目的，同時(shí)對(duì)植物具有促生和誘導(dǎo)抗性的作用[19]。本研究利用不同有機(jī)溶劑（正丁醇、乙酸乙酯和正己烷）對(duì)木霉的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了初步分離和篩選，結(jié)果顯示菌株T-43原液和乙酸乙酯提取物對(duì)枯梢病菌的生長(zhǎng)抑菌率均超過(guò)90%，病原菌在平板上生長(zhǎng)菌絲稀疏，生長(zhǎng)明顯變?nèi)跎踔敛簧L(zhǎng)，被完全抑制。T-43非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中抑菌活性成分對(duì)病原菌主要的保護(hù)酶活性的影響效果顯著，在48 h的處理過(guò)程中，初期SOD、CAT、POD、PPO酶活呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，10 h左右達(dá)到峰值，而后快速下降，24～48 h酶活幾乎為零，菌絲死亡，這與計(jì)紅芳[9]的研究結(jié)果一致。冀瑞卿[11]研究毒蘑菇活性成分對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌體內(nèi)自身保護(hù)相關(guān)酶系的影響、朱天輝[20]研究哈茨木霉代謝產(chǎn)物對(duì)立枯絲核菌的影響結(jié)果均表明，生防菌中非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物能強(qiáng)烈抑制病原菌的生長(zhǎng)和代謝的正常進(jìn)行，并破壞病原真菌菌絲的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，引起菌絲斷裂解體，并最終死亡。這些相關(guān)酶的變化與本研究的結(jié)果基本一致。病原菌保護(hù)酶雖然對(duì)外界的干擾有一定程度的抵抗作用，但是隨著時(shí)間的延續(xù)，外界干擾導(dǎo)致的病原菌自身保護(hù)酶系統(tǒng)的改變過(guò)程基本上是一致的。

本研究通過(guò)不同的方式對(duì)高效菌株進(jìn)行了評(píng)估，包括不同的菌劑類型、不同的濃度梯度、與國(guó)內(nèi)高效菌株和商品化木霉菌劑的比較。菌株T-43在連續(xù)兩年野外應(yīng)用中，均取得了良好的效果，可以有效控制病害的發(fā)生，說(shuō)明T-43具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)商品化木霉菌劑的潛力，筆者計(jì)劃進(jìn)一步對(duì)其代謝產(chǎn)物的活性成分進(jìn)行分離純化和工業(yè)化發(fā)酵的條件摸索。

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High efficient Trichoderma strains and theirs bio-control effects on shoot blight of Pinus sylvestris var. ongolica

DENG Xun1, SONG Rui-qing2, SONG Xiao-shuang1, YIN Da-chuang2
(1. Forestry Protection Institute of Heilongjiang Forestry Academy, Harbin 150040, Heilongjiang, China; 2. College of Forestry,Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang, China)

Trichderma strain T-43 which has inhibiting effects on Sphaeropsis sapinea was obtained from 28 domestic and foreign strains by methods of antagonistic culture and growth-inhibiting. The extraction effect of four organic solutions was evaluated by pathogen growth-inhibiting methods. The effect of the extract on pathogen’s protective enzyme activities was systematically studied. Two kinds of Trichoderma agent were prepared to control the shoot blight of Pinus sylvestris var. mongolica on field experiment. The results show that Trichoderma strain T-43 can inhibit the growth of Sphaeropsis sapinea,the inhibiting rate in antagonistic culture was 63.28%, and the relative inhibiting effect was 6.05. The non-violate extract from fermentation liquid of T-43 can inhibit the mycelia growth and the protective enzyme activity (including SOD, POD, CAT, PPO) of pathogen effectively. In field experiments of controlling shoot blight of Pinus sylvestris var. mongolica, the liquid agent was better than conidia WP.

Trichoderma; shoot blight of Pinus sylvestris var. mongolica; inhibiting mechanism; bio-control

S763.1

A

1673-923X(2012)11-0021-07

2012-10-10

948引進(jìn)項(xiàng)目（2009-4-39）；黑龍江省森工總局項(xiàng)目（SGZJY2010014）

鄧 勛（1978-），男，遼寧丹東人，副研究員，博士，主要從事微生物開(kāi)發(fā)利用研究；E-mail:dxhappy@126.com

宋瑞清（1964-），女，黑龍江哈爾濱人，教授, 博士生導(dǎo)師，主要從事菌物開(kāi)發(fā)及利用領(lǐng)域的研究

[本文編校:吳 毅]