王紅娟，鄭崢，楊潔

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046）

新疆疆岳驢乳粉增強(qiáng)小鼠免疫功能的研究

王紅娟，鄭崢，楊潔

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046）

探討驢乳凍干粉對環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能低下的影響。環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠免疫功能低下，給小鼠飼喂不同劑量的驢乳凍干粉，并于30 d后測定免疫指標(biāo)。結(jié)果表明：飼喂驢乳粉后，小鼠的T淋巴細(xì)胞陽性率由免疫低下組的23.89%上升至驢乳高劑量組的55.70%；白細(xì)胞數(shù)量由免疫低下組的4.36上升至高劑量組的9.21；吞噬率由免疫低下組的20.9%提高到高劑量組37.2%，吞噬指數(shù)由免疫低下組的0.31提高到驢乳高劑量組的0.62；小鼠胸腺指數(shù)由免疫低下組的0.012上升到高劑量組的0.02；CD4+/CD8+比例由免疫低下組的0.82提高到高劑量組的1.81,血清IgG質(zhì)量濃度由免疫低下組的0.453 g/L提高到高劑量組的0.727 g/L。驢乳不僅能提高機(jī)體的免疫能力，而且對環(huán)磷酰胺所造成的免疫低下具有緩解作用。

驢乳粉;環(huán)磷酰胺;免疫低下小鼠;免疫調(diào)節(jié)

0 引言

驢乳蛋白質(zhì)中富含人體必需氨基酸，同時(shí)含有豐富的兒童生長所必需的組氨酸[1]。大量臨床病例證實(shí)，約有3%三歲前的嬰幼兒會出現(xiàn)由IgE介導(dǎo)的牛乳過敏癥，驢乳可以作為牛乳過敏嬰幼兒的替乳食品[2]。同時(shí)驢乳可以治療多種疾病，如預(yù)防動脈粥樣硬化，增強(qiáng)血管神經(jīng)擴(kuò)張和作為有效地抗菌劑[3]，尤其對豬霍亂沙門氏菌和志賀痢疾桿菌的抗菌活性最為敏感[4,5]。此外，驢乳具有低脂肪、低膽固醇的特點(diǎn)[6]。

目前，國內(nèi)外相繼對牛乳抗炎性、降血脂、提高免疫力作用進(jìn)行了報(bào)道，但對驢乳影響動物機(jī)體免疫力的研究尚未見報(bào)道。因此本文通過研究不同質(zhì)量濃度驢乳凍干粉溶液對環(huán)磷酰胺所致免疫低下模型小鼠的影響，為研究驢乳的生理活性提供重要的基礎(chǔ)資料。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

受試物：驢乳凍干粉，采自新疆岳普湖的新鮮疆岳驢乳樣品，冷凍干燥后備用。

動物：昆明種小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，雌雄各半。

主要試劑：注射用環(huán)磷酰胺，飼料為全價(jià)顆粒狀飼料，貞芪扶正膠囊，羊抗小鼠IgG，HRP酶標(biāo)羊抗小鼠IgG，鄰苯二胺（OPD）。

儀器：AG204型分析天平，真空冷凍干燥機(jī)，酶標(biāo)儀，流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

小鼠稱重后隨機(jī)分為6組：正常組，免疫低下組，陽性對照組，驢乳粉低0.75 g（每千克體質(zhì)量)，中1.50 g（每千克體質(zhì)量)，高3.00 g（每千克體質(zhì)量)三個(gè)劑量組，每組10只。其中免疫低下組，陽性對照組，驢乳粉低、中、高3個(gè)劑量組在第1，5，10，15，20，25天，同時(shí)皮下注射環(huán)磷酸胺40 mg/kg，建立小鼠免疫低下模型。正常組和免疫低下組每日生理鹽水灌胃，陽性對照組灌胃貞芪扶正膠囊4.20 g（每千克體質(zhì)量)，3個(gè)劑量組分別用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的驢乳粉給小鼠灌胃，共30 d。第31天測定小鼠免疫指標(biāo)。

1.3 免疫指標(biāo)檢測

1.3.1 T淋巴細(xì)胞陽性率的測定

按照朱辛為等α-醋酸萘酯酶（ANAE）方法[7]，用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精將小鼠尾端局部消毒，待酒精干燥后用剪刀在尾端部約0.2 mm處剪掉，待血液自行流出后用玻片取血，推片，置于甲醛-丙酮固定液中固定，干燥，進(jìn)行ANAE染色。鏡檢100個(gè)淋巴細(xì)胞求得ANAE陽性百分率。

1.3.2 白細(xì)胞計(jì)數(shù)

小鼠眼球取血20 μL，加入0.38 mL白細(xì)胞稀釋液中混勻，取混勻稀釋血液1滴，滴入計(jì)數(shù)盤中，靜置2～3min，用低倍鏡計(jì)數(shù)四角的四大格中的白細(xì)胞總數(shù)。

1.3.3 巨噬細(xì)胞吞噬能力的測定

小鼠腹腔注射1 mL 2%雞紅細(xì)胞，脫臼處死，吸取腹腔液，滴一滴于玻片上，展開液滴，自然干燥，瑞士-姬姆薩染液染色。油鏡觀察巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的情況。吞噬指數(shù)=100個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/100；吞噬百分?jǐn)?shù)=100個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬了雞紅細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)/100。

臟器指數(shù)（mg/g）=（臟器重量/小鼠體質(zhì)量）×10。

1.3.4 T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比例的測定

按照陶冬青,陳如泉等測定CD4+/CD8+比例的方法[8-9]，每組取5只小鼠，眼眶采血0.5mL,加入5 μL肝素鈉抗凝。取50 μL肝素鈉抗凝全血，加入小鼠CD4-PE單抗、CD8-FITC單抗各10 μL，混勻，室溫反應(yīng)15 min。加入950 μL紅細(xì)胞裂解液?；靹?，室溫反應(yīng)15 min。1000 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS 500 μL洗兩次。PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.5 血清中免疫球蛋白IgG的測定

按照靳艷等用間接ELISA法測定IgG的方法[10-11]，特異羊抗小鼠IgG作為一抗包被酶標(biāo)板，HRP酶標(biāo)羊抗小鼠IgG作為檢測抗體，鄰苯二胺（OPD）為底物，測定小鼠血清樣品相應(yīng)的OD490；以標(biāo)準(zhǔn)IgG作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組小鼠血清IgG質(zhì)量濃度。

1.3.6 脾臟細(xì)胞形態(tài)觀察

取脾臟制作石蠟切片，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。采用方差分析ANOVA，結(jié)果以x±s表示，各項(xiàng)指標(biāo)的描述性數(shù)據(jù)均用“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，顯著性水平取ɑ=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫低下小鼠觀察

免疫低下組灌胃生理鹽水后小鼠形體消瘦，運(yùn)動遲緩，反應(yīng)遲鈍，體重明顯下降。陽性對照組與驢乳灌胃組精神狀況良好，行動靈活，且隨著驢乳劑量的增加，精神狀況更佳，呈劑量依賴性。

2.2 對免疫低下小鼠T淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞的影響

表1為驢乳粉對小鼠T淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞的影響。由表1可以看出，與正常組相比，環(huán)磷腺胺所致的免疫低下組T淋巴細(xì)胞陽性率、白細(xì)胞數(shù)明顯下降，且差異顯著（P＜0.05），說明造模成功。與免疫低下組相比，灌胃驢乳各組T淋巴細(xì)胞陽性率和白細(xì)胞數(shù)明顯升高，高劑量組T淋巴細(xì)胞陽性率和白細(xì)胞數(shù)幾乎達(dá)到陽性對照組水平。

表1 對小鼠T淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞的影響

T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，并在機(jī)體針對TD抗原的體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要輔助作用。灌胃驢乳后，T淋巴細(xì)胞陽性率明顯上升，說明驢乳可刺激T淋巴細(xì)胞數(shù)量增長,對提高機(jī)體免疫功能有促進(jìn)作用。白細(xì)胞能吞噬異物產(chǎn)生抗體，在機(jī)體損傷治愈、抗御病原入侵和對疾病免疫方面起重要的作用。機(jī)體發(fā)生炎癥或其他疾病都可引起白細(xì)胞總數(shù)及各種白細(xì)胞百分比發(fā)生變化，因此白細(xì)胞總數(shù)成為檢測免疫作用的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。驢乳對環(huán)磷腺胺所致的免疫低下小鼠WBC下降有保護(hù)作用，可增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。

2.3 對免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

表2為驢乳粉對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。如表2所示，與正常組相比免疫低下組的吞噬指數(shù)和吞噬率明顯下降，差異顯著（P＜0.05）。與免疫低下組相比，各劑量驢乳組巨噬細(xì)胞和吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬率均有提高。3個(gè)劑量組與免疫低下組之間差異顯著（P＜0.05），其中高劑量組作用最強(qiáng)，與陽性對照組無顯著差異（P＞0.05）。

巨噬細(xì)胞有很強(qiáng)的吞噬能力，主要吞噬外來顆粒如微生物、大分子（包括抗原分子）甚至損傷或死亡的自身組織。此外，巨噬細(xì)胞將攝取和處理后的抗原提呈于細(xì)胞表面，供抗原特異性T淋巴細(xì)胞識別，參與特異性免疫反應(yīng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明灌胃驢乳能顯著地提高小鼠巨噬細(xì)胞活性。

表2 對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

2.4 對免疫低下小鼠T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+和IgG的影響

CD4+淋巴細(xì)胞亞群以Th細(xì)胞為主，CD8+淋巴細(xì)胞亞群以Ts細(xì)胞為主,CD4+淋巴細(xì)胞能增強(qiáng)和擴(kuò)大機(jī)體的免疫應(yīng)答,CD8+淋巴細(xì)胞能抑制免疫應(yīng)答過程，兩種作用相反的T淋巴細(xì)胞借助相互拮抗,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答。CD4+/CD8+的比值反映機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境是否穩(wěn)定，兩者平衡決定了免疫反應(yīng)的總效應(yīng)，若比值偏離正常值，說明機(jī)體免疫功能失調(diào)。與正常組相比，免疫低下組的CD4+/CD8+比例下降，且差異顯著（P＜0.05），說明造模成功。3個(gè)不同質(zhì)量濃度驢乳粉劑量組的CD4+/CD8+比例均呈上升趨勢，中低劑量組與免疫低下組差異不顯著（P＞0.05），其中高劑量組與免疫低下組差異顯著（P＜0.05）（表3）。結(jié)果說明灌胃驢乳可有效地改善CD4+／CD8+比值的降低，且有一定的劑量依賴性。

表3 對小鼠T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+和IgG的影響

IgG是血清和細(xì)胞外液中主要的抗體成分，對多種細(xì)菌和病毒有抑制和中和作用。與正常組相比，免疫低下組IgG質(zhì)量濃度顯著降低。3個(gè)劑量組血清中IgG的質(zhì)量濃度較免疫低下組增高，且差異顯著（P＜0.05），且高劑量組與陽性對照組無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果說明驢乳能改善環(huán)磷胺造成的免疫低下，可提高免疫低下小鼠血液中IgG水平。

2.5 對免疫低下小鼠臟器指數(shù)的影響

通過驢乳凍干粉對免疫低下的小鼠臟器指數(shù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表4所示。由表4可以看出，免疫低下小鼠的胸腺指數(shù)下降，與正常組相比差異顯著（P＜0.05）。各灌胃驢乳組與正常組相比，中劑量和高劑量組已達(dá)正常組水平。各灌胃驢乳組的肝指數(shù)也上升，但各組差異不顯著（P＞0.05）。胸腺是機(jī)體細(xì)胞免疫的中樞器官，對外周免疫器官的發(fā)育起主導(dǎo)作用，其功能狀態(tài)直接決定機(jī)體細(xì)胞免疫功能，并間接影響體液免疫功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明環(huán)磷腺胺導(dǎo)致小鼠免疫器官胸腺萎縮，而驢乳粉對小鼠免疫器官胸腺有明顯的保護(hù)作用。

表4 驢乳粉對小鼠臟器指數(shù)的影響

2.6 脾臟細(xì)胞形態(tài)觀察

通過石蠟切片對不同處理組的脾臟細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，正常組的脾臟細(xì)胞形態(tài)特征為細(xì)胞多為橢圓形，排列密集，邊界清晰，形態(tài)完整，胞質(zhì)豐富致密，著色深（圖1（a））；免疫低下組的脾臟細(xì)胞數(shù)量明顯減少，大部分細(xì)胞縮小，細(xì)胞邊緣不整齊，胞質(zhì)大量減少，空虛部分較多，著色較淺（圖1（b））；隨著驢乳質(zhì)量濃度劑量的增高，脾臟細(xì)胞逐漸規(guī)則完整，驢乳高劑量組脾臟細(xì)胞多為橢圓形，細(xì)胞排列密集，大小較一致，邊界清晰，形態(tài)完整，胞質(zhì)豐富，較致密，著色深（圖1（e））。這種變化可能是由于細(xì)胞活動功能降低、血液和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，以及神經(jīng)內(nèi)分泌刺激減少引起器官的實(shí)質(zhì)細(xì)胞體積或數(shù)目的減少所致。只要原因消除，已萎縮的細(xì)胞、組織可回復(fù)原狀。結(jié)果說明驢乳能夠緩解環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的脾臟萎縮，對免疫器官有一定的修復(fù)作用。

3 結(jié)果與討論

驢乳中富含溶菌酶、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，主要成分與人乳非常相似[12]。Criscione等[13]研究發(fā)現(xiàn)驢乳中的蛋白具有多態(tài)性，采自不同地方的驢乳樣，通過測定成分發(fā)現(xiàn)，有的驢乳中缺乏αs1酪蛋白，有的缺乏β-乳球蛋白II。Cunsolo等[14]對驢乳的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)驢乳中10%的蛋白組分可以通過已有的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定，70%的蛋白組分只能通過與驢同源的馬屬的蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定，另有20%蛋白組分尚未鑒定。因此有必要對驢乳的生理功能與生物活性成分進(jìn)行進(jìn)一步研究。

為了探討驢乳對小鼠免疫力的影響作用，本研究以新疆岳普湖縣的疆岳驢驢乳為研究對象，以不同質(zhì)量濃度的驢乳凍干粉溶液飼喂環(huán)磷酸胺致免疫低下小鼠，分別統(tǒng)計(jì)觀察不同處理組小鼠的形態(tài)、T淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量、巨噬細(xì)胞吞噬功能、對T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+和IgG的影響以及用顯微石蠟切片技術(shù)觀察了不同處理組脾臟細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果表明，驢乳能夠有效地提高免疫低下小鼠的免疫力。通過灌胃驢乳溶液，能夠改善環(huán)磷酰胺造成的CD4+/CD8+比例失調(diào)，對被環(huán)磷酰胺破壞的免疫器官起到一定的修復(fù)作用，可提高機(jī)體T淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量以及提高腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)和吞噬率，能增高血清中IgG質(zhì)量濃度，部分免疫指標(biāo)可基本達(dá)到正常水平。隨著驢乳質(zhì)量濃度增加，小鼠免疫力增強(qiáng)，這暗示了驢乳對提高免疫功能具有劑量依賴性。新疆是我國養(yǎng)驢最多的省(區(qū))[15]，大力發(fā)展驢乳業(yè)不僅可以很好的促進(jìn)我國新型乳制品的開發(fā)、推動我國乳品工業(yè)發(fā)展，也可以因地制宜，充分挖掘新疆驢乳產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)為新疆驢乳的綜合開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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Immune function influence of Xinjiang Jiangyue Donkey Milk Powder on immunodepressed mice

WANG Hong-juan,ZHENG Zheng,YANG Jie
(College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

To observe the donkey milk powder on immunodepression induced by cyclophosphamide in mice.The immunodepression was induced by cyclopho*sphamide,the different dose of donkey milk powder were given to mice for 30 days and measure parameters.The masculine ratio of T lymphocytes increased from 23.89%of immundepressed group to 55.70%of high-dose donky milk group；WBC number increased from 4.36 of immundepressed group to 9.21 of high-dose donky milk group；Phagocytosis rate increased from 20.9%of the immundepressed group to 37.2%，Phagocytic index increased from 0.31 of immundepressed group to 0.62 of high-dose group of donky milk, increased by nearly two times；Thymus index increased from 0.012 of immundepressed group to 0.02 of high-dose donky milk group;CD4+/CD8+rate increased from 0.62 of immundepressed group to 1.81 of high-dose group of donky milk,IgG increased from 0.453 of the immundepressed group to 0.727.Donkey milk powder can improve the immunity，and alleviate immunodepression caused by cyclophosphamide in mice.

donkey milk powder;cyclophosphamide;immunodepressed mice;immune function modulate

Q936

A

1001-2230（2012）05-0020-04

2011-12-12

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(No.2010211A04),自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目計(jì)劃項(xiàng)目(No.201191255)。

王紅娟(1986-)，女,碩士研究生，從事生化制藥與食品生物學(xué)研究。

楊潔