李先勝，姜鐵民，陳歷俊,

(1.大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100085)

酵母菌對發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)和蛋白的影響

李先勝1，姜鐵民2，陳歷俊1,2

(1.大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100085)

探討了酵母菌對酸奶蛋白和質(zhì)構(gòu)的影響。添加酵母菌沒有對酸奶的質(zhì)構(gòu)造成顯著性的影響，添加酵母菌的樣品沒有產(chǎn)生更多種類的多肽，但是氨基氮和游離氨基酸質(zhì)量濃度下降，這可能是酵母菌與乳酸菌之間存在對營養(yǎng)物質(zhì)競爭利用的原因。

質(zhì)構(gòu)；多肽；氨基氮；氨基酸

0 引言

在乳制品發(fā)酵過程中乳酸菌發(fā)酵占主導(dǎo)地位，但在亞洲、東歐、非州等傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，如Kefir、Koumiss、Airag、Amasi、Cheeses產(chǎn)品中，酵母菌和乳酸菌起著同樣重要的作用，酵母能夠為產(chǎn)品帶來期望的香氣和風(fēng)味[1]。近年來，不斷發(fā)現(xiàn)酵母菌作為附屬發(fā)酵劑對乳制品發(fā)酵和成熟過程中的風(fēng)味影響、抑制有害菌的生長及對人體的潛在益生功能等[2-4]。

酵母菌產(chǎn)生的二氧化碳會破壞凝乳，但二氧化碳能促進乳酸菌的活性，同時也能有效抑制有害微生物的生長，延長有害微生物的生長周期[5]。C.zeylanoides、K.marxianus、Yarrowia.lipolytica、Debaryomyces hansenii、Geotrichum candidum這些酵母菌對蛋白質(zhì)有很強的水解作用[6]。

本文選用傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中常見的酵母菌Kluyveromyces marxianus和Saccharomyces cerevisiae，探討酵母菌對酸奶質(zhì)構(gòu)和蛋白的影響，為開發(fā)新型發(fā)酵乳制品提供理論支持。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

酵母菌：馬克思克魯維酵母和釀酒酵母，乳酸菌（丹尼斯克直投菌種YO-MIX611）：嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌。

1.1.2 材料與試劑

脫脂奶粉，Whatman定量濾紙NO.1，3 ku超濾離心管，乙腈，三氟乙酸，其他試劑均為分析純，鄰苯二甲醛試劑：準確秤取40 mg的OPA溶解于1 mL甲醇中，加入100 μL β-巰基乙醇、0.95 g四硼酸鈉、0.5 g SDS，溶解后定容50 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配，AccQ Tag Ultra化學(xué)包。

1.1.3 儀器

離心機，質(zhì)構(gòu)儀（TA.XT.Plus），C-18反相柱（Venusil ASB C18 4.6*250 mm/5 um），雙光束紫外可見分光光度計（Cintra20），高效液相色譜儀（LC10Avp），超高效液相色譜儀（ACQUITY），氨基酸分析色譜柱（AccQ·Tag Ultra色譜柱2.1 mm×100 mm，1.7 μm），pH計。

1.2 方法

1.2.1 酸奶的制作

將酵母菌和乳酸菌對數(shù)值分別以5.3 mL-1和6.3 mL-1的初始濃度接種到滅菌（110℃，10 min）的120 g/ L的脫脂奶中，于30℃下發(fā)酵，pH值降低至4.6時結(jié)束發(fā)酵，置于4℃冰箱中保存。

1.2.2質(zhì)構(gòu)儀程序設(shè)定

測定前下降速度為2 mm/s，測定速度為1 mm/s，測定距離為30 mm，測定后速度10 mm/s。采用A/BE探頭，直徑35 mm。測定前用1 kg砝碼進行質(zhì)構(gòu)儀較正。

1.2.3 氨基氮質(zhì)量分數(shù)通過OPA法測量

取一定量的凝乳，置于研缽中，研磨成細小顆粒后用手持均質(zhì)機均質(zhì)2 min。用濃度為1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至4.6，室溫下靜置30 min，在3 000 g離心30 min。上清液（pH46可溶性部分）用Whatman定量濾紙（NO.1）過濾，濾液保存于-20℃待用。

取50 μL上清液加入1 mL鄰苯二甲醛試劑中，室溫下計時反應(yīng)2 min，340 nm處測定吸光度。氨基酸標準曲線的制作：配制質(zhì)量濃度為1 g/L的亮氨酸溶液，稀釋后質(zhì)量濃度分別為50，100，200，300，400和500 mg/L的標準溶液系列，按照上述方法測定吸光度，制作標準曲線，計算樣品中氨基氮的質(zhì)量濃度。

1.2.4 氨基酸質(zhì)量分數(shù)的測定

將上清液pH值調(diào)至8.2～10之間，用3 ku的超濾離心管進行超濾，再用AccQ Tag Ultra方法進行氨基酸的柱前衍生，具體方法如下:(1)將樣品、AccQ·Tag Ultra硼酸鹽緩沖劑和中和試劑添加到完全回收樣品瓶中。(2)加入20 μLAccQ·Tag Ultra試劑，立即渦旋混合幾秒鐘,等待1 min。(3)將樣品瓶置于55°C下加熱10 min。液相檢測器、梯度洗脫程序和樣品管理器設(shè)置如表1-表3所示。流動相A為洗脫液A1，流動相B為洗脫液B。

表1 PDA檢測器參數(shù)

表2 UPLC梯度洗脫程序

1.2.5 反相色譜法檢測pH4.6可溶部分多肽的變化

取保存的pH值為4.6上清液，用0.22 μm的膜過濾后，用于液相分析。液相分析條件：采用C-18柱，柱溫為35℃。液相條件：溶劑A為體積分數(shù)0.1%的TFA水溶液；溶劑B為體積分數(shù)0.1%的TFA乙腈溶液，流速為0.8 mL/min，檢測波長為214 nm。上樣量為10 μL。梯度洗脫程序如表4所示。

表3 樣品管理器參數(shù)

表4 RP-HPLC梯度洗脫程序

2 結(jié)果分析

2.1 質(zhì)構(gòu)的變化

酵母菌產(chǎn)生的二氧化碳會破壞凝乳，但傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳清是要排出的，發(fā)酵過程從產(chǎn)生的氣體破壞凝乳，這有助于乳清的排出[7]。發(fā)酵初期酵母菌會通過有氧呼吸消耗掉脫脂奶中溶解的氧氣，使乳酸菌的產(chǎn)酸速度加快，從而增加凝乳的硬度[8]。表5為酸奶的質(zhì)構(gòu)。

由表5可以看出，不同酵母菌對酸奶的硬度、稠度、黏度和黏聚性均有一定的影響，添加馬克思克魯維酵母和釀酒酵母的樣品在硬度、稠度、黏度和黏聚性上均有所增加,但沒有發(fā)生顯著性的增加（P＜0.05）。說明酵母菌的添加沒有對酸奶的質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生顯著性的影響。

2.2 多肽的變化

C18色譜柱能使分子量小于5 000 u的多肽達到較好的分離效果，出峰時間越晚，多肽的相對疏水性越強。圖1為pH4.6-SN液相分析結(jié)果。

由圖1可以看出，pH值為4.6可溶性多肽是由多種不同極性的肽段組成，脫脂奶經(jīng)發(fā)酵后多肽的種類增加。添加酵母菌樣品的色譜圖與未添加酵母菌樣品的色譜圖基本一致，說明酵母菌的添加沒有增加多肽的種類，酸奶在發(fā)酵過程中，起主要作用的是乳酸菌。

2.3 氨基氮質(zhì)量濃度的變化

氨基氮主要包括一些小肽和游離氨基酸，它們對酸奶風(fēng)味產(chǎn)生重要作用。質(zhì)量分數(shù)為12%的TCA可溶性肽是小于7肽的小肽。發(fā)酵劑的蛋白酶和肽酶對12% TCA可溶性氮貢獻較大。采用鄰苯二甲醛分光光度法測定12%TCA可溶性組分中氨基氮的質(zhì)量濃度結(jié)果如表6所示。

表5 酸奶的質(zhì)構(gòu)

表6 氨基氮質(zhì)量濃度

由表6可以看出，酵母菌和乳酸菌對脫脂奶進行發(fā)酵后的樣品，與未添加酵母菌的樣品相比氨基氮質(zhì)量濃度有了一定程度的下降，其中添加釀酒酵母菌樣品的氨基氮含量顯著下降（P＜0.05）。這可能是酵母菌和乳酸菌之間存在營養(yǎng)物質(zhì)競爭利用的原因。

2.4 游離氨基酸質(zhì)量濃度的變化

游離氨基酸是影響發(fā)酵乳制品風(fēng)味的重要組成成分，其中許多小肽的風(fēng)味是由其末端的氨基酸決定的；由于高質(zhì)量濃度的游離氨基酸對感官有促進作用，總游離氨基酸質(zhì)量濃度與良好風(fēng)味的提高密切相關(guān)[9]；其中芳香族氨基酸、支鏈脂肪酸和甲硫氨酸是風(fēng)味化合物的主要前體物質(zhì)，特別是甲硫氨酸能提供一種良好的黃油味和奶香味[10]。陳歷水研究表明，酵母菌單獨發(fā)酵后牛乳的游離氨基酸質(zhì)量濃度有所增加，酵母菌能分泌一定量的蛋白酶、肽酶或者氨基轉(zhuǎn)移酶，通過這些酶對牛乳中的蛋白質(zhì)進行水解得到了更多的游離氨基酸[11]。

酵母菌和乳酸菌對脫脂奶進行發(fā)酵后的樣品，與未添加酵母菌的樣品相比總的游離氨基酸含量有了一定程度的下降，分別從272.36 mg/L下降到218.67 mg/L（馬克思克魯維酵母）和150.84 mg/L（釀酒酵母）。單個游離氨基酸含量也發(fā)生了變化，如蛋氨酸從2.28下降到1.74 mg/L（馬克思克魯維酵母）和0.62 mg/L（釀酒酵母）；脯氨酸從67.75 mg/L下降到55.33 mg/L（馬克思克魯維酵母）和54.99 mg/L（釀酒酵母）；異亮氨酸從5.11 mg/L下降到3.44 mg/L（馬克思克魯維酵母）和2.08 mg/L（釀酒酵母）。添加酵母菌后氨基酸的質(zhì)量濃度有所下降，這可能是酵母菌與乳酸菌之間存在對營養(yǎng)物質(zhì)競爭利用的原因。

3 結(jié)論

酵母菌沒有對酸奶的硬度、稠度、黏度和黏聚性產(chǎn)生顯著性的影響，添加酵母菌樣品與未添加酵母菌樣品的pH4.6上清液相比，沒有產(chǎn)生更多種類的多肽，添加酵母菌的樣品的氨基氮含量有所下降，其中添加釀酒酵母樣品的氨基氮質(zhì)量濃度顯著下降（P＜0.05），添加酵母菌樣品的氨基酸質(zhì)量濃度有所下降，這可能是酵母菌與乳酸菌之間存在對營養(yǎng)物質(zhì)競爭利用的原因。

表7 發(fā)酵酸乳游離氨基酸質(zhì)量濃度mg/L

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Influence of yeasts on protein and texture of fermented milk

LI Xian-sheng1，JIANG Tie-min2，CHEN Li-jun1,2
（1.Dalian Polytechnic University,Dalian 116034，China;2.Beijing Sanyuan Foods CO.Ltd.,Beijing 100085，China）

The influence of yeasts on yogurt protein and texture were investigated.The effect of yeasts on texture of yogurt was not significant. The samples added yeasts did not produce more peptide.The content of amino nitrogen and free amino acid were decreased.The reason may be that yeasts and LAB exist nutrient competition.

texture；polypeptide；amino nitrogen；amino acid

TS252.1

A

1001-2230（2012）05-0030-04

2012-02-14

國家科技部“十一五”支撐計劃（2009BADB9B06），國家“863”計劃(2011AA100903)，北京市科技計劃(D10110504600000)。

李先勝（1984-），男，碩士研究生，從事食品微生物方面的研究。

陳歷俊