粘靖祺，田芬，項(xiàng)麗麗，霍貴成

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.光明乳業(yè)股份公司，上海 200000）

嗜酸乳桿菌應(yīng)用高質(zhì)量分?jǐn)?shù)脫脂乳的發(fā)酵工藝優(yōu)化

粘靖祺1，田芬1，項(xiàng)麗麗2，霍貴成1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.光明乳業(yè)股份公司，上海 200000）

將篩選出的嗜酸乳桿菌接種于25%的高質(zhì)量分?jǐn)?shù)脫脂乳中發(fā)酵,在單因素pH值、溫度以及接種量試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝，獲得高濃度的嗜酸乳桿菌活菌。結(jié)果表明：高質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%脫脂乳培養(yǎng)基對菌株的生長有一定促進(jìn)作用，得到高活菌數(shù)嗜酸乳桿菌的最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵pH值為5.81、發(fā)酵溫度37.30℃、接種量3.18%，活菌數(shù)可達(dá)2.78×109mL-1。

嗜酸乳桿菌；高質(zhì)量分?jǐn)?shù)脫脂乳；發(fā)酵條件；響應(yīng)面法

0 引言

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)廣泛應(yīng)用于發(fā)酵制品和膳食輔助材料中，是具有平衡人體胃腸道菌群、治療腹瀉、降低膽固醇和抑制有害菌等促健康作用的益生菌[1]，具有較高的開發(fā)價(jià)值[2]。脫脂乳是一種常用且易獲取的發(fā)酵培養(yǎng)基原料，可供給乳酸菌生長所需的充足營養(yǎng)[3]，另外固形物量較大，具有良好的酸堿緩沖作用[4]。本實(shí)驗(yàn)通過對脫脂乳培養(yǎng)基濃度的調(diào)整、培養(yǎng)基營養(yǎng)因子的改良、發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化，使嗜酸乳桿菌達(dá)到高密度發(fā)酵。在工業(yè)化生產(chǎn)中，將含有高濃度脫脂乳的發(fā)酵液直接進(jìn)行干燥處理，制備成活菌含量較高的益生菌粉，去除了其他培養(yǎng)基帶來的多種工業(yè)化后處理的困難，不但縮減了成本，并且降低了發(fā)酵液染菌的概率[5]，為大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)益生菌菌粉提供了一條實(shí)用的工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株：嗜酸乳桿菌KLDS AD3-SU（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心提供）。

材料與設(shè)備：MRS優(yōu)化培養(yǎng)基；脫脂乳；KLF2000 3.7L發(fā)酵罐；電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9272；HCl (0.01mol/L),NaOH（0.01mol/L）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌的傳代、活化和計(jì)數(shù)

將篩選出的性能較好的嗜酸乳桿菌KLDS AD3-SU用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%脫脂乳活化，于37℃恒溫箱里培養(yǎng)24 h左右，活化3代；選擇不同濃度的脫脂乳來進(jìn)行發(fā)酵，活菌計(jì)數(shù)采用稀釋傾注法。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%脫脂乳培養(yǎng)基滅菌條件：110℃，10 min，分別從葡萄糖添加量，pH值，接種量，溫度4個單因素進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)[6]。以活菌數(shù)為指標(biāo)，分別于14 h（該菌株的穩(wěn)定期前期時(shí)間）取菌液測活菌數(shù)。

葡萄糖添加量分別為1%，2%，3%，4%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；發(fā)酵pH值分別設(shè)為5.8，6.0，6.2，6.4；發(fā)酵溫度分別設(shè)為30，34，37，40℃；接種量分別設(shè)為1%，2%，3%，4%。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化嗜酸乳桿菌在高濃度發(fā)酵液的發(fā)酵條件

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵pH值(x1)、發(fā)酵溫度(x2)和接種量(x3)3個因素為自變量，以活菌數(shù)為響應(yīng)值，進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

1.2.4 模型的驗(yàn)證

通過響應(yīng)面法優(yōu)化嗜酸乳桿菌發(fā)酵高質(zhì)量分?jǐn)?shù)脫脂乳，取得高密度活菌，得出最佳工藝條件，并用驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證該模型的有效可行性。每個試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。采用Design Expert 7.1軟件和Microsoft Excel 2003統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、差異顯著性分析和響應(yīng)面分析[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線的比較

圖1為嗜酸乳桿菌KLDS AD3-SU在不同濃度的脫脂乳培養(yǎng)基中的生長趨勢。由圖1可以看出，在4種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的脫脂乳中，嗜酸乳桿菌KLDS AD3-SU的生長趨勢較為接近，進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間均為14 h，相比其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%脫脂乳中生長的嗜酸乳桿菌活菌數(shù)最高，可能原因?yàn)橘|(zhì)量分?jǐn)?shù)高的脫脂乳中固形物含量較高，故營養(yǎng)物質(zhì)含量充足，可更好的滿足該菌株生長。相較于其他3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)脫脂乳，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%脫脂乳中的生長趨勢較為平緩?？赡苁怯捎谳^高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的脫脂乳對產(chǎn)生的乳酸有一定的緩沖能力，降低了因發(fā)酵液環(huán)境中的局部酸度過高而抑制嗜酸乳桿菌生長的情況。將嗜酸乳桿菌接種于大于質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%的脫脂乳中生長的趨勢及活菌數(shù)基本一致。因此，本研究選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的脫脂乳作為培養(yǎng)基。工業(yè)發(fā)酵一般采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～12%的脫脂乳發(fā)酵乳酸菌[4]，下游中再添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的脫脂乳作為保護(hù)劑進(jìn)行噴霧干燥。本實(shí)驗(yàn)為避免分批分步添加脫脂乳的工藝繁瑣，多次添加輔料造成工藝染雜菌的情況，同時(shí)可降低成本，故一次性添加25%脫脂乳作為培養(yǎng)基，達(dá)到了更好的優(yōu)化工業(yè)發(fā)酵條件的效果。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)乳酸菌利用糖代謝的方式，其優(yōu)先利用葡萄糖作為碳源[8]，為使嗜酸乳桿菌的穩(wěn)定期提前，嘗試在培養(yǎng)基中添加不同梯度的葡萄糖與未添加葡萄糖，比較嗜酸乳桿菌KLDS AD3-SU在不同培養(yǎng)基中生長趨勢的差異，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，得到在12 h時(shí)活菌數(shù)的明顯差異。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道添加益生元對嗜酸乳桿菌的生長有促進(jìn)作用[9-10]，但本研究添加果糖和菊粉后[11-12]，活菌提升變化不明顯，可能是本研究篩選的菌株更偏愛于吸收葡萄糖，另外高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的脫脂乳培養(yǎng)基中提供給微生物生長所需的營養(yǎng)成分充足，因此不再另外添加營養(yǎng)因子。

如圖2所示，添加葡萄量為2%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大，所以在單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面優(yōu)化中，都均向質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%脫脂乳中添加2%的葡萄糖作為培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)間從原來的14 h提前到12 h，單因素實(shí)驗(yàn)的活菌數(shù)都是在14 h下測定的。

圖3為pH值對活菌數(shù)的影響。如圖3可以看出，pH值變化對高濃度培養(yǎng)基中嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)影響明顯。為了降低pH值到5.6，加入的HCl過多導(dǎo)致酪蛋白沉淀，不利于菌種通過代謝蛋白進(jìn)行繁殖，從而抑制了菌株生長，當(dāng)發(fā)酵pH值為5.8時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大，隨發(fā)酵pH值繼續(xù)增加，活菌數(shù)呈逐漸下降趨勢，嗜酸乳桿菌比較偏向于酸性環(huán)境，pH值的繼續(xù)升高對其生長不利[13]。

圖4為接種量對活菌數(shù)的影響。如圖4可以看出，隨時(shí)接種量的增加，活菌數(shù)呈上升趨勢，在接種量3%時(shí)嗜酸乳桿菌活菌數(shù)KLDS AD3-SU的活菌數(shù)最高，當(dāng)接種量達(dá)到4%時(shí)，活菌數(shù)降低，可能是由于初期菌體產(chǎn)生的乳酸過多，反而抑制了活菌數(shù)的增加。因此接種量選擇3%為宜。

圖5為溫度對活菌數(shù)的影響。如圖5可以看出，發(fā)酵溫度[14]的對嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)影響顯著。從30℃到37℃，隨著溫度上升，活菌數(shù)也相應(yīng)提高，達(dá)到37℃時(shí)，活菌數(shù)最高，隨后活菌數(shù)隨發(fā)酵溫度的升高呈逐漸下降趨勢。說明37℃是該菌最適宜生長的溫度，該菌的耐熱性差，溫度過高反而抑制其生長。

2.3 響應(yīng)面模型的建立及其顯著性

根據(jù)上面單因素試驗(yàn)的結(jié)果,通過Design Expert7.1軟件對培養(yǎng)條件設(shè)計(jì)了3因素3水平試驗(yàn),所得數(shù)據(jù)分析結(jié)果如表2所示。

然后對上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明：交互項(xiàng)pH值與溫度、pH值與接種量對活菌數(shù)的影響不顯著，各單因素及溫度和接種量交互作用對活菌數(shù)的影響均顯著（P＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著，回歸模型的決定系數(shù)為0.9905，說明該模型能夠解釋99.05%的變化，該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，因此，可用此模型對嗜酸乳桿菌在高濃度脫脂乳中發(fā)酵的發(fā)酵條件進(jìn)行分析和預(yù)測。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析

比較F值可知，3因素對嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)影響大小依次為：接種量＞pH值＞發(fā)酵溫度。并且3個因素的影響均為極顯著（P＜0.01）。利用Design Expert軟件，對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，可得到響應(yīng)值活菌數(shù)對數(shù)y對編碼自變量x1、x2和x3的回歸方程為

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面分別如圖6～圖8所示。

由圖6可以看出，兩個因素的交互項(xiàng)不顯著，由響應(yīng)面可以看出，接種量值不變，活菌數(shù)隨溫度和pH值的增加而迅速增加，當(dāng)溫度為37～37.5℃時(shí)，活菌數(shù)最高。pH值在5.7～5.9范圍內(nèi)，活菌數(shù)較高。

由圖7可以看出，兩個因素的交互項(xiàng)也不顯著，由響應(yīng)面可以看出，溫度不變，活菌數(shù)隨pH的升高而逐漸增加，當(dāng)pH值超過5.9時(shí)，活菌數(shù)降低。同樣的，由圖8可以看出，發(fā)酵溫度在30～37℃，接種量在2.5%～3.8%范圍內(nèi)，活菌數(shù)較高。相關(guān)研究表明，在較低的pH值培養(yǎng)的乳酸菌菌存活率高，而在最適pH值的菌存活率低[15]，因此在生產(chǎn)嗜酸乳桿菌活菌制品時(shí)，可考慮在一定范圍內(nèi)降低pH值，以延長存活期。

2.4 最優(yōu)條件的確定

通過上述回歸模型，采用Design-Expert 7.1軟件優(yōu)化發(fā)酵條件，獲得嗜酸乳桿菌KLDS AD3-SU在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)脫脂乳中的最適發(fā)酵條件為：發(fā)酵pH值5.81，發(fā)酵溫度37.30℃，接種量3.18%，在此條件下活菌數(shù)（對數(shù)值）為9.44289 mL-1，即2.78×109mL-1。采用上述條件進(jìn)行實(shí)際的驗(yàn)證，經(jīng)過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到活菌數(shù)的平均值為3.12×109mL-1，試驗(yàn)值與分析值的相對誤差為0.5%，較優(yōu)化前提高的36.19%。證明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的發(fā)酵條件準(zhǔn)確可靠具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

通過數(shù)據(jù)分析及響應(yīng)面法對嗜酸乳桿菌在高濃度的脫脂乳中發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的脫脂乳培養(yǎng)家中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的葡萄糖，并得到嗜酸乳桿菌KLDS AD3-SU最優(yōu)發(fā)酵條件。在以后的研究中應(yīng)根據(jù)以上結(jié)論再對凍干條件和噴干進(jìn)出口溫度的控制進(jìn)行探索,以提高該菌的存活率。本實(shí)驗(yàn)針對中小型企業(yè)提供了一種方便快捷的生產(chǎn)直投式發(fā)酵劑的方法，根據(jù)本課題研究思路可對其他乳酸菌的工業(yè)擴(kuò)大生產(chǎn)，提供了便利的前提條件。

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Optimized the high mass fraction Fermentation Conditions for Lactobacillus acidophilus

NIAN Jing-qi1，TIAN Fen1，XIANG Li-li2,HUO Gui-cheng1
(1.Key Lab of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China, 2.Bright Dairy&Food Co.,Ltd Shanghai 200000,China)

Using response surface methodology(RSM)for optimized the fermentation conditions for Lactobacillus acidophilus,high mass fraction of skimmed milk was used as the medium,based on the single factor tests of fermentation pH,fermentation temperature and inoculation amount.Results suggested that contain 25%of the high mass fraction of skimmed milk can partly promote the growth of Lactobacillus acidophilus,the optimal culture conditions:pH 5.8,inoculation amount of 3.18%and fermentation temperature of 37.30℃.the viables could reach 2.78×109cfu/ml.

Lactobacillus acidophilus;high mass fraction of skimmed milk;technical condition optimization;response surface method

TS252.1

A

1001-2230（2012）05-0034-04

2012-12-07

“乳酸菌代謝調(diào)控與發(fā)酵劑制造技術(shù)”教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助（IRT0959）。

粘靖祺（1987-），女，碩士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)與微生物。

霍貴成