周雪晴，謝艷麗，趙振東，馮玉紅

（海南省精細化工重點實驗室，海南大學分析測試中心，?？?570228）

柱前衍生–反相高效液相色譜法測定荔枝果蒂中的氨基酸*

周雪晴，謝艷麗，趙振東，馮玉紅

（海南省精細化工重點實驗室，海南大學分析測試中心，海口 570228）

建立了AccQ·Tag柱前衍生-高效液相色譜法測定荔枝果蒂中氨基酸含量的方法。荔枝果蒂樣品在120℃下真空水解22 h，再與AQC衍生劑進行衍生，并采用反相液相色譜法-熒光檢測器進行分析，外標法計算樣品中17種氨基酸的含量。17種氨基酸在35 min內(nèi)可完全分離，荔枝果蒂中氨基酸的含量在2.5～25 μmol／L范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)不小于0.999。方法的加標回收率在71.2%～92.0%之間，測定結(jié)果的相對標準偏差為3.16%～9.94%（n=6），方法的檢出限（S／N=3）在 0.000 5～0.001 2 mg／L之間。

柱前衍生；液相色譜法；荔枝果蒂；氨基酸

荔枝(Litchi Chinensis)是中國南部出產(chǎn)的一種熱帶水果，其味道甜美，汁液豐富，享有“嶺南果王”和“果中珍品”等美譽［1，2］，在海南、廣東、廣西和福建均有種植。荔枝肉中含有豐富的維生素C和蛋白質(zhì)，有助于增強機體免疫功能，荔枝還具有消腫解毒、止血止痛的作用。氨基酸是食物和飲料中的一類生物活性成分，是重要的營養(yǎng)物質(zhì)并影響食品的品質(zhì)。水果果蒂中的氨基酸含量與水果生長和成熟程度有顯著的相關(guān)性，可用于確定果實的最佳采摘成熟度［3］。

有人對荔枝中的糖、酸、蛋白質(zhì)、微量元素、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)進行了研究［4，5］，但對荔枝果蒂中的氨基酸分析研究還鮮有報道。筆者采用柱前衍生-高效液相色譜法測定荔枝果蒂中的氨基酸含量，對不同品種的荔枝果蒂氨基酸成分進行分析，為荔枝品種的營養(yǎng)評價及采摘成熟度提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters 2695型，附帶2475型熒光檢測器，美國Waters公司；

電子分析天平：AB265-S型，梅特勒-托利多儀器有限公司；

旋渦混勻器：IKA MS3 basic型，德國IKA公司；

超聲清洗機：KS-120EI型，寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司；

真空干燥箱：VD23型，德國Binder公司；

針筒過濾器：0.22 μm，上海興亞凈化材料廠；

乙腈、甲醇：色譜純，美國Sigma公司；

17種氨基酸混合標準液：濃度均為2.5 mmol／L，美國Waters公司；

實驗所用其它試劑均為分析純；

Waters AccQ ·Fluor硼酸緩沖液（Buffer1）；

Waters AccQ·Fluor衍生劑粉末（2A）；

Waters AccQ ·Fluor衍生劑稀釋液（2B）［6-7］；

AQC衍生劑：由Waters AccQ·Fluor衍生劑粉末（2A）加Waters AccQ·Fluor衍生劑稀釋液（2B）得到；

大丁香、無核荔、小丁香、妃子笑4種荔枝樣品：購自?？谑修r(nóng)貿(mào)市場，取果蒂部分，粉碎備用；

超純水：用英國ELGA超純水儀制得。

1.2 樣品處理

（1）鹽酸水解

稱取100 mg 果蒂樣品放入150 mm×15 mm水解試管中，加入10 mL 6 mol／L 鹽酸，用液氮或干冰冷凍樣品直至固化，將試管抽真空直至真空計低于7 Pa，在真空下密封試管，于(110±1)℃水解22 h，得樣品水解液。

（2）樣品衍生化

過濾1.0 mL樣品水解液，取10 μL放入50 mm×6 mm衍生管中(干燥)，加入70 μL Buffer1緩沖液，渦旋混合并加入20 μL AQC衍生劑，渦旋混合15 s。樣品管用石臘膜封口，置于55℃烘箱中加熱10 min，待檢測。

分別取 17 種氨基酸混合標準液 1，2，4，5，10 μL，與樣品同時進行衍生化。

1.3 色譜條件

Waters AccQ·Tag氨基酸分析柱（150 mm×3.9 mm，5 μm）；熒光檢測器：λex=250 nm，λem=395 nm ；增益：1；進樣體積：10 μL；色譜柱溫度：37℃；流速：1.0 mL／min；流動相洗脫條件見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

儀器條件中流動相比例對荔枝果蒂中的氨基酸測定具有重要的影響。通過變化不同的梯度洗脫程序，確定在本實驗所采取的洗脫條件下17種氨基酸在35 min內(nèi)全部出峰，且具有較好的分離效果。在此條件下，以峰面積作為定量指標，17種氨基酸［天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、賴氨酸(Lys)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)］標準品色譜圖見圖1。

表1 流動相洗脫條件

圖1 17種氨基酸標準品色譜圖

2.2 方法的線性方程、線性范圍及檢岀限

分別吸取 2.5 μmol／L 氨基酸標準液 1，2，4，5，10 μL，與樣品同時衍生化后進行測定，以氨基酸溶液濃度(x)為橫坐標、以色譜峰面積(y)為縱坐標繪制氨基酸的標準工作曲線，線性范圍為2.5～25 μmol／L，以3倍信噪比計算檢出限。17種氨基酸標準的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。

2.3 方法的回收率及精密度

稱取6份荔枝果蒂作為平行樣，分別加入一定量的氨基酸標準溶液，按實驗方法進行處理、測定，分別計算平均回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表3。

由表3可知，本分析方法的加標回收率在71.2%～92.0%之間，測定結(jié)果的相對標準偏差在3.16%～9.94%之間，可滿足氨基酸測定的要求。

表2 17種氨基酸線性關(guān)系

表3 加標回收試驗結(jié)果(n=6)

2.4 樣品測定

應(yīng)用所建立的方法對4種荔枝果蒂樣品進行測定，測定結(jié)果見表4。

由表4可知，在4個荔枝品種的果蒂水解氨基酸中，以酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、纈氨酸(Val)為主要氨基酸，其總量超過氨基酸總量的60%，其中，大丁香以酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)含量較高，占總氨基酸的44.5%；無核荔以組氨酸(His)、亮氨酸(Leu)、谷氨酸(Glu)含量較高，占總氨基酸的40.5%；小丁香以蛋氨酸(Met)含量最高，占總氨基酸的18.5%，其次是賴氨酸(Lys)、纈氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)；妃子笑中以組氨酸(His)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)及纈氨酸(Val)含量較高，占總氨基酸的52.2%。4種荔枝果蒂的總氨基酸含量從大到小依次為無核荔、妃子笑、大丁香、小丁香。

表4 4種荔枝果蒂樣品水解氨基酸測定結(jié)果

3 結(jié)語

采用柱前衍生-反相高效液相色譜法測定荔枝果蒂中的水解氨基酸含量，衍生化反應(yīng)完全，17種氨基酸分離良好，回收率好，精密度較高，可用于類似氨基酸的檢測分析。

對不同品種荔枝果蒂的氨基酸進行分析，能夠為研究和開發(fā)荔枝資源，全面了解荔枝品質(zhì)的形成提供重要的參考依據(jù)。

［1］崔珊珊，胡卓炎，余愷，等.不同產(chǎn)地妃子笑荔枝果汁的氨基酸組分［J］.食品科學，2011，32(12)： 269-273.

［2］李建國.荔枝學［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008.

［3］王燕.不同品種荔枝核營養(yǎng)成分及功能活性的研究［D］.廣州：華南農(nóng)業(yè)大學，2009.

［4］陳華萍，陳黎，魏育明，等.柱前衍生反相高效液相色譜法測定小麥中氨基酸含量［J］.分析化學，2005，33(12)： 1 689-1 692

［5］Campo C P，Garde-Cerdan T，Sanchez A M，et al. Determination of free amino acids and ammonium ion in saffron (Crocus savitus L.)from different geographical origins［J］. Food Chemistry，2009，114(4)： 1 542-1 548.

［6］劉保冬，王維，等.葡萄酒中游離氨基酸的高效液相色譜法測定［J］.分析測試學報，1997，16(6)： 5-7.

［7］朱曙東，趙昇皓.氨基酸的高效液相色譜分析［J］.色譜，1994，12(1)： 20-23.

［8］Ribeiro B，Andrade P B，Silva M B，et al. Comparative studyon free amino acid composition of wild edible mushroom species［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(22)： 10 973-10 979.

Determination of Amino Acids in Pedicel of Litchi Chinensis by AccQ·Tag–High Performance Liquid Chromatography

Zhou Xueqing, Xie Yanli, Zhao Zhendong, Feng Yuhong
(Hainan Provincial Key Lab of Fine Chem， Chemical Analytical and Testing Center of Hainan University，Haikou 570228，China)

A method for the determination of 17 amino acids in pedicel ofLitchi Chinensiswas established.The amino acids in pedicel ofLitchi Chinensiswere hydrolyzed at 120℃ in the vacuum for 22 h, then the hydrolyte were derivated by AQC reagent and determined by HPLC-FLD. The 17 amino acids were separately within 35 min. The content of amino acids in pedicel ofLitchi Chinensishad good relationship in the range of 2.5-25 μmol／L, the correlation coefficient was not less than 0.999. The recoveries were in the range of 71.2%-92.0%, and the relative standard deviations of determination results were 3.16%-9.94%(n=6). The detection limits (S／N=3) were 0.000 5-0.001 2 mg／L .

precolumn derivatization; high performance liquid chromatography; pedicel of litchi chinensis; amino acids

O657.7+2

A

1008–6145(2012)05–0022–03

doi ：10.3969／j.issn.1008–6145.2012.05.006

*海南大學2010年青年基金項目（qnjj1003）;海南大學研究生創(chuàng)新平臺科研項目基金

聯(lián)系人：周雪晴；E-mail： zhouxueqing001@sina.com

2012-06-19