王苗苗，李群艷，韋 奇，聶祚仁

（北京工業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，北京，100124）

近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球的制備及漆酶固定化

王苗苗，李群艷，韋 奇，聶祚仁

（北京工業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，北京，100124）

以自制近單分散、平均粒徑約為250 nm的SiO2亞微球?yàn)楹诵?，采用液相沉積法得到β-FeOOH/SiO2微球，再通過溶膠-凝膠法以β-FeOOH/SiO2微球?yàn)閮?nèi)核，十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）為模板劑，正硅酸乙酯（TEOS）為硅源，經(jīng)水解縮聚反應(yīng)，焙燒后得到近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球，以復(fù)合微球?yàn)檩d體，對漆酶進(jìn)行固定。結(jié)果表明，近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2復(fù)合微球的介孔層厚約40 nm，具有較大的飽和磁化強(qiáng)度（14.715 emu/g），較小的剩余矯頑力（約為109 Oe），其比表面積為391.067 m2/g，孔容為0.53 cm3/g，孔徑分別在5.43 nm和20～80 nm, 呈現(xiàn)雙孔徑分布。復(fù)合微球吸附漆酶后，介孔材料的比表面積與孔容分別減小為103 m2/g和0.37 cm3/g，復(fù)合微球?qū)ζ崦傅奈搅繛?02.6 mg/g。

介孔二氧化硅 納米 漆酶 固定化

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶[1]，具有相當(dāng)廣泛的底物專一性和較好的穩(wěn)定性，因此漆酶在生物傳感器、治理含酚廢水和工業(yè)廢水方面有著巨大的應(yīng)用前景[2,3]。由于漆酶溶于水，不易回收利用，在實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用中受到限制。為了避免游離酶在工業(yè)應(yīng)用中的缺點(diǎn)，F(xiàn)orde等[4]將漆酶成功地固定于介孔材料內(nèi)，不僅提高酶的固定量及活性，還提高了它的穩(wěn)定性及對環(huán)境適應(yīng)能力，在生產(chǎn)中得到了更廣泛的應(yīng)用。Na等[5]成功地將微過氧化物酶固定于有機(jī)官能化修飾后的大孔徑PMOs介孔孔道內(nèi)，顯著提高了微過氧化物酶的固定量。目前，越來越多的研究者將介孔材料作為固定生物酶分子的優(yōu)良載體[6-9]。近年來，納米磁性介孔材料在多相催化、化學(xué)傳感器、生物分離、藥物的靶向傳輸和生物醫(yī)藥等研究領(lǐng)域展現(xiàn)出傳統(tǒng)無機(jī)多孔材料與之無法比擬的優(yōu)越性和廣闊的應(yīng)用前景，成為固定化酶的優(yōu)良載體[10-14]。磁性介孔二氧化硅材料的制備方法主要有三種：一種是原位法[15,16]，方法簡單，耗時(shí)少，但是制備過程中對復(fù)合材料微觀結(jié)構(gòu)的調(diào)控性差，難以有效控制材料的磁性能和介孔性能；第二種是兩步法[17]，這種方法制備的磁性介孔二氧化硅材料往往存在不均勻、鐵和硅結(jié)合力差等缺點(diǎn)；第三種是核-殼結(jié)構(gòu)法[18]，在制備好的磁性顆粒表面上，通過硅源反應(yīng)得到磁性介孔二氧化硅材料。核-殼結(jié)構(gòu)法制備的磁性介孔二氧化硅材料避免了前兩種方法的缺點(diǎn)，越來越多地應(yīng)用于磁性介孔二氧化硅材料的制備。前期工作以自制的單分散 SiO2為核心[19]，得到一種新型結(jié)構(gòu)的介孔SiO2/Fe3O4中空磁性微球，該介孔磁性復(fù)合微球具有可調(diào)的孔徑、可控的磁性，尺寸均一及無生理毒性的特點(diǎn)，并且Fe3O4納米結(jié)構(gòu)具有超順磁性能，有利于顆粒的分離與再分散[20-22]。但是由于介孔SiO2/Fe3O4中空磁性微球中中空結(jié)構(gòu)的存在，雖然復(fù)合微球具有低密度、高比表面積的優(yōu)點(diǎn)，但是導(dǎo)致復(fù)合微球結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易坍塌破壞，將這種中空結(jié)構(gòu)的磁性微球進(jìn)一步應(yīng)用到生物酶的固定存在數(shù)據(jù)重復(fù)性差等問題。本工作以具有尺寸均一、介孔層與磁性層獨(dú)立可控、磁性能良好，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的近單分散介孔 SiO2/Fe3O4/SiO2微球?yàn)檩d體材料，對漆酶進(jìn)行固定化，考察了其對漆酶固定性能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

以硅溶膠作為種子，在含有氨水和乙醇的水溶液中，通過TEOS的水解得到單分散的SiO2微球，以其為核心，采用液相沉積法在SiO2核心表面多次包覆β-FeOOH層，得到β-FeOOH/SiO2微球。其中，核心SiO2的顆粒尺寸為250 nm，二價(jià)鐵鹽FeCl2·4H2O的濃度為0.1 mol/L，體系的pH值為4.2，實(shí)驗(yàn)步驟見文獻(xiàn)[19]。采用溶膠-凝膠法，對β-FeOOH/SiO2微球進(jìn)行介孔SiO2的涂層。在實(shí)驗(yàn)過程中，以0.047 mol/L的CTAB為模板劑，0.053 mol/L的TEOS為硅源，在水溶液反應(yīng)體系中，與0.108 mol/L的NaOH混合，經(jīng)水解縮聚反應(yīng)，得到介孔SiO2/β-FeOOH/SiO2沉淀，將沉淀在一定條件下焙燒，最終得到近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球，具體的實(shí)驗(yàn)步驟見文獻(xiàn)[20]。

漆酶固定化實(shí)驗(yàn)：取10 mg制備的近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球與5 mL濃度為1 mg/mL的漆酶溶液在4 ℃的環(huán)境下攪拌12 h，離心，得到固定化漆酶的近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球樣品。

1.2 漆酶活性的測定[23]

將一定體積的游離漆酶或固定化漆酶加入到等體積的1.0 mmol/L的ABTS溶液中，于25 ℃反應(yīng)一定時(shí)間，冰浴終止反應(yīng)，離心分離，采用紫外-可見分光光度計(jì)測定上清液在420 nm處吸光度的變化值，以此計(jì)算相應(yīng)酶活。每分鐘使每微摩爾的ABTS氧化所需的酶量為一個(gè)酶活單位，固定化酶活性用每克載體的酶活單位（U/g）表示。游離漆酶或固定化漆酶的相對活性是以在同組實(shí)驗(yàn)中將活性最高點(diǎn)的值記為100%，其余實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的值與該點(diǎn)的值之比，通常以百分?jǐn)?shù)表示。

1.3 樣品表征

用JEM-2010型透射電子顯微鏡（TEM，工作電壓為200 kV）觀察樣品的結(jié)構(gòu)及包覆層厚度；采用日本島津XRD-7000型X射線衍射（XRD）儀表征粉體的晶型結(jié)構(gòu)；采用振動樣品磁性計(jì)（HH-15）在室溫下測試樣品的磁性能；采用MicromeriticsASAP 2020比表面全自動物理吸附儀分析材料的吸附-脫附等溫線，通過計(jì)算得到樣品的比表面積、孔徑和孔容；采用ThermoEvolution 600紫外分光光度計(jì)測定固定酶、游離酶的固定量及其活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球的性能

單分散SiO2，β-FeOOH/SiO2和SiO2/Fe3O4/SiO2微球的TEM照片見圖1。由圖可知：SiO2微球單分散性很好，尺寸均一，約250 nm；SiO2微球進(jìn)行兩次β-FeOOH包覆后得到核殼結(jié)構(gòu)β-FeOOH/SiO2微球（見圖1（b）），此時(shí)，SiO2微球表面包覆層是由平均長度約為40 nm的β-FeOOH納米棒搭建而成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，同時(shí)保持了與SiO2微球相同的單分散性。β-FeOOH/SiO2微球進(jìn)行介孔二氧化硅包覆，并將近單分散介孔SiO2/β-FeOOH/SiO2微球在500 ℃進(jìn)行焙燒，去除模板劑，繼續(xù)將樣品在H24%（體積分?jǐn)?shù)）與96%Ar混合氣體中還原2 h，得到近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球的TEM照片見圖1（c）和（d）。由圖可知，SiO2/Fe3O4/SiO2介孔復(fù)合微球依然保持了良好的單分散性，且顆粒尺寸較均勻，約320 nm，在介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球表面均勻包覆了無序介孔二氧化硅層。

圖1 不同樣品的TEM照片F(xiàn)ig.1 TEM images of different samples

圖2為介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球樣品的XRD圖，圖中的衍射峰位與Fe3O4（PDF卡號為65-3107）衍射峰位一致，因此，所制備的復(fù)合粒子不含任何雜相，具有純的Fe3O4晶相。在衍射角為23°左右的寬峰來源于無定形SiO2殼層的衍射。

近單分散介孔 SiO2/Fe3O4/SiO2微球的室溫磁滯回線見圖3，該樣品在所加磁場范圍內(nèi)基本達(dá)到飽和，復(fù)合磁性微球的飽和磁化強(qiáng)度為14.715 emu/g，左上角插圖為磁滯回線的局部放大圖，從圖中可以看出該樣品的矯頑力約為109 Oe，與解林艷等[20]制備得到的中空磁性介孔復(fù)合微球（飽和磁化強(qiáng)度為13.6 emu/g，矯頑力較大約為50 Oe）相比，飽和磁化強(qiáng)度相當(dāng)，矯頑力有所增大。但將制備得到的近單分散介孔 SiO2/Fe3O4/SiO2微球分散在水中，施加一個(gè)永磁體后仍可以在30 s內(nèi)完全富集，撤掉永磁體后，用手輕輕搖動容器，復(fù)合微球又可以迅速重新分散，可實(shí)現(xiàn)介孔復(fù)合微球在液體中的磁分離。

圖2 去模板劑及還原氣氛焙燒后樣品的XRD圖譜Fig.2 XRD pattern of mesoporous SiO2/ β-FeOOH/SiO2 microspheres after template removal and calcination in reducing atmosphere

圖3 介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球的室溫磁滯回線及磁場分離效果照片F(xiàn)ig.3 Magnetic hysteresis loop of mesoporous SiO2/Fe3O4/SiO2 microspheres and the separation process of particles

2.2 近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球載體對漆酶吸附前后的孔結(jié)構(gòu)

近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球吸附漆酶前后的等溫曲線及其孔徑分布圖如圖4所示。由圖可知，近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球的吸附曲線屬于第Ⅳ類等溫線，在P/P0為0.35～0.45出現(xiàn)一個(gè)滯后環(huán)，氮?dú)馕搅考眲≡黾?，意味著孔尺寸較小，孔徑分布較窄，在P/P0為0.8～1.0出現(xiàn)另一個(gè)滯后環(huán)，說明眾多的小顆粒之間形成的二次孔結(jié)構(gòu)及包覆在核心二氧化硅表面的由納米棒搭接而成的不規(guī)則的孔結(jié)構(gòu)。從孔徑分布圖（b）和（c）可以看出，在5.0 nm左右有一個(gè)很寬的孔徑分布，并在20～80 nm內(nèi)具有較寬、較低的孔徑分布。表1為漆酶固定前后介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球的結(jié)構(gòu)參數(shù)。由表可知，近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球的比表面積為391.067 m2/g，孔容為0.53 cm3/g。雖然與中空的介孔復(fù)合微球[20]（比表面積為693 m2/g，孔容為0.63 cm3/g）相比，比表面積與孔容均有一定程度的減小。但是均大于普通的核殼結(jié)構(gòu)介孔磁性材料[24,25]的比表面積（283 m2/g）和孔容（0.349 cm3/g），和“搖鈴”狀介孔磁性材料[26]的比表面積（436 m2/g）和孔容（0.53 cm3/g）數(shù)值相當(dāng)。當(dāng)漆酶分子進(jìn)入介孔材料的孔道后，介孔材料的孔容和比表面積都有所下降，比表面積減小為103.288 m2/g，孔容減小為0.37 cm3/g，但復(fù)合微球的平均孔徑增大。這是由于漆酶分子占據(jù)了介孔復(fù)合微球中較小的介孔孔道，介孔載體的孔徑在5.43 nm處的分布比例極大減小，20～80 nm的孔徑分布比例明顯增加，導(dǎo)致復(fù)合微球的平均孔徑增大。這說明漆酶分子占據(jù)了大部分孔徑在5.00 nm左右的孔道，介孔SiO2/Fe3O4/SiO2磁性微球?qū)ζ崦高M(jìn)行了有效的吸附。這種近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2磁性微球的平均孔徑為5.43 nm，大于漆酶的分子尺寸（6 nm×5 nm×4.5 nm），因此漆酶分子很容易進(jìn)入到介孔 SiO2/Fe3O4/SiO2磁性微球的介孔孔道內(nèi)，這證明孔容的減小程度與酶分子直徑和孔徑匹配程度有很大關(guān)系。

圖4 介孔SiO2/Fe3O4/SiO2磁性微球吸附漆酶前后的N2吸附脫附曲線及孔徑分布Fig.4 N2 absorption-desorption isotherms of mesoporous SiO2/Fe3O4/SiO2 microsphere and Laccase-mesoporous(a)-SiO2/Fe3O4/SiO2 microsphere; (b)-pore size distribution of mesoporous SiO2/Fe3O4/SiO2 microsphere;(c)-pore size distribution of Laccase-mesoporous SiO2/Fe3O4/SiO2 microsphere

表1 漆酶固定前后介孔SiO2/Fe3O4/SiO2磁性微球的結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Structural parameters of mesoporous SiO2/Fe3O4/SiO2 microsphere and Laccase-mesoporous SiO2/Fe3O4/SiO2 microsphere

2.3 近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球固定化漆酶的吸附動力學(xué)

圖5為近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球與自制的MCM-41介孔SiO2材料（比表面積為854.7 m2/g，孔容為0.642 cm3/g，平均孔徑為3 nm）對漆酶的吸附量隨時(shí)間的變化情況。由圖可知，介孔SiO2/Fe3O4/SiO2磁性微球在2 h內(nèi)，吸附速率較快，且吸附量急劇增加，隨著時(shí)間的不斷增加，載體對漆酶的吸附量也逐漸增大，當(dāng)時(shí)間達(dá)到3 h后，載體對漆酶的吸附逐漸飽和，實(shí)驗(yàn)得到飽和吸附量（qe）為202.6 mg/g，達(dá)到吸附平衡狀態(tài)。MCM-41介孔材料的吸附速率較慢，約5 h達(dá)到吸附平衡，對漆酶的最大吸附量qe為349.8mg/g。

介孔 SiO2/Fe3O4/SiO2微球的吸附動力學(xué)是根據(jù)吸附動力學(xué)模型對吸附進(jìn)程及吸附結(jié)果進(jìn)行分析，從而揭露物質(zhì)結(jié)構(gòu)與吸附性能之間的關(guān)系，對固定化酶的實(shí)際應(yīng)用具有至關(guān)重要的影響。常用的吸附動力學(xué)模型是準(zhǔn)二級動力學(xué)吸附速率模型（pseudo-second-order model），其方程式為：

對式（1）兩邊積分得到線性形式為：

式中：qe為平衡時(shí)的吸附量，mg/g；qt為t時(shí)間時(shí)的吸附量，mg/g；k為二級吸附速率常數(shù)，g/(mg·h)。以t/qt～t作圖，結(jié)果見圖 6。介孔磁性復(fù)合微球?qū)ζ崦肝搅康臄M合直線為Y=2.612×10-4+5.12×10-3X，MCM-41介孔材料對漆酶吸附量的擬合直線為Y=1.88×10-3+2.76×10-3X，相關(guān)系數(shù)（R2）分別為 0.998和0.997，即所得兩條曲線線性相關(guān)性較好，說明兩種介孔材料對漆酶的吸附行為符合準(zhǔn)二級動力學(xué)模型。由直線的斜率可得SiO2/Fe3O4/SiO2磁性微球?qū)ζ崦傅淖畲笪搅縬e為195.3 mg/g，與實(shí)驗(yàn)值202.6 mg/g相近，微球的二級吸附速率常數(shù)k為0.100 g/(mg·h)，大于純介孔材料MCM-41的二級吸附速率常數(shù)（0.004 g/(mg·h)）。表明漆酶在復(fù)合微球中具有更快的吸附速率。這是由于MCM-41介孔材料的平均孔徑較近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球的平均孔徑5.43 nm小，漆酶分子較難進(jìn)入MCM-41介孔材料的介孔孔道，因此MCM-41介孔材料對漆酶的吸附速率較慢。但是MCM-41介孔材料的比表面積與孔容較大，因此當(dāng)材料達(dá)到吸附平衡時(shí)，單位質(zhì)量的介孔材料 MCM-41所吸附的漆酶量較近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球多。

圖5 漆酶在介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球載體和MCM-41上吸附量隨時(shí)間變化情況Fig.5 Changes of laccase absorption on mesoporous SiO2/Fe3O4/SiO2 microsphere and MCM-4 with time

圖6 t/qt與t的關(guān)系Fig.6 Relationship between t/qt and t

3 結(jié) 論

以單分散SiO2微球?yàn)楹?，?FeOOH為殼，再以β-FeOOH/SiO2微球?yàn)閮?nèi)核，介孔SiO2為殼，制備的這種核殼結(jié)構(gòu)的近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球，尺寸均一、可控，其磁化強(qiáng)度為14.715 emu/g，矯頑力約為 109 Oe，有利于介孔復(fù)合微球的再分散，在磁場的作用下，可實(shí)現(xiàn)藥物的靶向運(yùn)輸及分離。近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球固定漆酶后，比表面積與孔容由391.067 m2/g，0.53 cm3/g分別減小為103 m2/g和0.37 cm3/g，介孔載體的孔徑在5.0 nm左右的分布比例極大減小，說明介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球?qū)ζ崦高M(jìn)行了有效地吸附。近單分散介孔SiO2/Fe3O4/SiO2微球作為載體，對漆酶的固定量為202.6 mg/g，吸附速率大于純介孔材料MCM-41。

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Monodisperse Mesoporous SiO2/Fe3O4/SiO2Microspheres: Preparation and Laccase Immobilization

Wang Miaomiao, Li Qunyan, Wei Qi, Nie Zuoren
(College of Materials Science and Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)

The home-made monodispersed SiO2microspheres with uniform size(250 nm) were coated withβ-FeOOH to prepareβ-FeOOH/SiO2microspheres by liquid deposition method. Then the SiO2/β-FeOOH/SiO2microspheres, prepared by coating a mesoporous silica layer on theβ-FeOOH/SiO2microspheres with sol-gel method, were calcinated and reduced to obtain the final mesoporous SiO2/Fe3O4/SiO2microspheres. The magnetic composited microspheres exhibited some good properties, such as high surface area (391.067 m2/g),large pore (0.53 cm3/g), high saturation magnetization (14.715 emu/g) and low coercivity (109 Oe). Furthermore the mesoporous SiO2/Fe3O4/SiO2microspheres were used as a carrier to immobilize the laccase. The surface area and the pore volume of the composite microsphereas decreased to 103 m2/g and 0.37 cm3/g, respectively, after immobilizing laccase. The adsorbance amount of laccase in mesoporous material was about 202.6 mg/g.

mesoporous silica; nanometer; laccase; immobilization

O611 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

1001—7631 ( 2012 ) 02—0122—07

2012-03-22；

2012-04-09

王苗苗（1986-），女，碩士研究生；李群艷（1974-），女，副教授，通訊聯(lián)系人。E-mail: qyli@bjut.edu.cn

國家863計(jì)劃課題（2009AA03Z213）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21171014）