崔小進(jìn)，楊帆，戴有金，李章富，呂永通，胡風(fēng)慶

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院生物材料與生物制藥實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng)110036)

Delta-睡眠肽(Delta sleep inducing peptide，DSIP)是一種存在于動(dòng)物體內(nèi)的促睡眠物質(zhì)，由Monnier等［1］于1963年從被微電流刺激的家兔腦靜脈血通過(guò)體外血液透析等方法分離得到。Delta-睡眠肽為T(mén)rp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu 9個(gè)氨基酸所構(gòu)成，是分子量為848.98 u的九肽［2］。將其注射到動(dòng)物靜脈，可以增強(qiáng)慢波睡眠時(shí)相的Delta-波及睡眠梭形活動(dòng)，即有促進(jìn)睡眠的作用，故稱(chēng)為Delta-睡眠肽。DSIP作用于睡眠的途徑并未得到透徹的研究，一些研究顯示DSIP是通過(guò)影響腦中血清素(serotonin)和γ-氨基酪酸(GABA)的釋放來(lái)產(chǎn)生促睡眠作用的［3］。研究還顯示內(nèi)源性的DSIP參與了許多肽類(lèi)激素的調(diào)控:它可以抑制促甲狀腺激素、促生長(zhǎng)素抑制素的分泌，刺激促黃體激素、生長(zhǎng)激素、促生長(zhǎng)激素釋放激素的分泌［4-5］，此后隨著研究的深入，DSIP還被發(fā)現(xiàn)具有多種生理功能，因此被視為一種多功能的神經(jīng)調(diào)節(jié)肽，這些功能中最顯著的生理活性就是其應(yīng)激保護(hù)作用。DSIP作為一種應(yīng)激限制因子(stresslimiting factor)可以降低環(huán)境中緊張因素對(duì)機(jī)體的損害，人體中內(nèi)源性DSIP水平在35歲后會(huì)有升高來(lái)減少應(yīng)激反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損害［6］。在免疫應(yīng)答中，DSIP還可以起到免疫調(diào)節(jié)劑的作用，并能促進(jìn)細(xì)胞分化兼具有抗腫瘤的作用［7］。DSIP具有降低體溫的特性［8］;DSIP還具有舒張血管的活性，高血壓的人或老鼠接受DSIP后，血壓會(huì)下降;DSIP具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的作用;DSIP還可以通過(guò)增強(qiáng)腦啡肽與鴉片受體的作用而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用;DSIP具有抗酒精和抗鴉片活性，可抑制對(duì)于酒精和鴉片的依賴(lài);另外DSIP還具有抗驚厥的作用。由于Delta-睡眠肽在體內(nèi)的含量極少，分離純化起來(lái)，不但繁瑣且非常困難，加之又有了對(duì)Delta-睡眠肽一級(jí)結(jié)構(gòu)的了解，人們開(kāi)始試圖通過(guò)化學(xué)合成的方法來(lái)獲得Delta-睡眠肽，并且取得了一定的成功。早在1979年，就報(bào)道了Delta-睡眠肽及其類(lèi)似物的合成工作［9］。此后，對(duì)其合成、生物活性及構(gòu)效關(guān)系的研究均取得進(jìn)一步發(fā)展，為其臨床應(yīng)用提供了進(jìn)一步的依據(jù)。本研究對(duì)DSIP基因進(jìn)行克隆，構(gòu)建載體pET-28a-DSIP，但由于目的編碼區(qū)過(guò)短，DSIP無(wú)法實(shí)現(xiàn)表達(dá)。在質(zhì)粒pET-28a-DSIP中插入一段編碼含有265個(gè)氨基酸殘基的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因，通過(guò)融合表達(dá)的方法成功實(shí)現(xiàn)了DSIP的表達(dá)，并純化得到GFP-DSIP融合蛋白，為進(jìn)一步研究DSIP的生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株原核表達(dá)載體pET-28a質(zhì)粒，購(gòu)自Novagen公司;pEGFP-C1表達(dá)載體以及E.coli BL21(DE3)菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑限制性?xún)?nèi)切酶，T4 DNA連接酶，DNA Marker，均購(gòu)自TaKaRa公司;小量質(zhì)粒提取試劑盒，Pfu高保真DNA聚合酶，RNA酶，DNA回收試劑盒，均購(gòu)自上海生工生物工程公司;B型超純質(zhì)粒小樣快速提取試劑盒，購(gòu)自寶信生物技術(shù)有限責(zé)任公司;親和層析介質(zhì)Ni-NTA His-Bind Resin，購(gòu)自Qiaqing公司;其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 SOE PCR擴(kuò)增DSIP基因序列根據(jù)DSIP基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引入編碼腸激酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基序列和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)DSIP1:5'-TCCGAATTCGACGACGACGACAAATGGGCTGGTGGTGACGC-3'。下游引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)DSIP2:5'-GTGCTCGAGATTATTCACCGGAAGCGTCACC-ACCAGCCCA-3'。利用上述引物進(jìn)行SOE-PCR拼接延伸出整個(gè)DSIP基因及腸激酶識(shí)別位點(diǎn)序列。反應(yīng)條件為95℃5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，用膠回收試劑盒純化并回收。

1.2.2 表達(dá)載體pET-28a-DSIP的構(gòu)建用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)純化的DSIP目的片段和pET-28a質(zhì)粒在37℃雙酶切過(guò)夜，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后分別純化回收。在16℃，T4連接酶作用下，將DSIP片段和pET-28a過(guò)夜連接，然后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序鑒定。

1.2.3 綠色熒光蛋白基因的PCR擴(kuò)增根據(jù)GFP基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引入NdeⅠ酶切位點(diǎn)GFP1:5'-GTACATATGATGGTG AGCAAGGGCGAG-3'。下游引入酶切位點(diǎn)BamHⅠGFP2:5'-ATTGAATTCTCTAGATCCGG TGGAGCCC-3'，以質(zhì)粒pEGFP-C1為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增GFP。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，58℃退火60 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，用膠回收試劑盒純化并回收。

1.2.4 表達(dá)載體pET28a-GFP-DSIP的構(gòu)建GFP基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切后插入到載體pET-28a-DSIP，然后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，挑取陽(yáng)性克隆雙酶切鑒定，測(cè)序鑒定。

1.2.5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)菌種中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。菌液經(jīng)37℃振揺培養(yǎng)過(guò)夜后以1∶100比例接種到新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600值約為0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)4 h，收菌進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳(SDSPAGE)鑒定誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.6 融合蛋白的純化取過(guò)夜培養(yǎng)菌液10 mL，接入200 mL含Kan(40 μg/mL)的LB培養(yǎng)基，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6后IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，培養(yǎng)結(jié)束后離心收集菌體;將菌體重懸于4 mL結(jié)合緩沖液中，加入溶菌酶至1 mg/mL，超聲破碎菌體后離心去除不溶性細(xì)胞碎片。收集上清參照鎳親和層析柱使用說(shuō)明過(guò)鎳親和層析柱純化融合蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET28a-GFP-DSIP的構(gòu)建

2.1.1 DSIP的SOE PCR擴(kuò)增結(jié)果根據(jù)設(shè)計(jì)的引物DSIP1和DSIP2，SOE PCR擴(kuò)增DSIP，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物大小為57 bp，預(yù)期結(jié)果基本一致，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 SOE PCR擴(kuò)增DSIP基因結(jié)果Fig.1 SOE PCR of DSIP

2.1.2 GFP的PCR擴(kuò)增結(jié)果根據(jù)設(shè)計(jì)的引物GFP1和GFP2，PCR擴(kuò)增GFP，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物大小為798 bp，預(yù)期結(jié)果基本一致，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 綠色熒光蛋白基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR of GFP

2.1.3 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果用BamHⅠ和NdeⅠ酶切重組質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳分析得到789和5 360 bp左右2條條帶，與預(yù)期相符，該重組質(zhì)粒經(jīng)酶切電泳鑒定正確，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 pET28a-GFP-DSIP雙酶切驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Identification of pET28a-GFP-DSIP by digesting with restiction enzymes

對(duì)重組質(zhì)粒中插入的序列進(jìn)行測(cè)序鑒定，經(jīng)Blast序列分析軟件比對(duì)，結(jié)果表明，GFP以及DSIP基因正確插入到了pET-28a載體中，成功構(gòu)建了pET28a-GFP-DSIP重組載體。

2.2 重組GFP-DSIP融合蛋白的表達(dá)純化鑒定結(jié)果

表達(dá)質(zhì)粒pET28a-GFP-DSIP經(jīng)1 mmol/L IPTG于30℃誘導(dǎo)4 h，SDS-PAGE結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒株菌誘導(dǎo)后有1條明顯的融合蛋白表達(dá)條帶。從圖4中可以看出GFP-DSIP融合肽的分子量與預(yù)期大小(32 ku)相符。融合蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析柱分離純化后，在SDS-PAGE中顯示出預(yù)期大小的純化后的蛋白條帶(圖4)。

圖4 GFP-DSIP誘導(dǎo)表達(dá)及純化的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE of expression and purification of GFP-DSIP

3 討論

自從發(fā)現(xiàn)Delta-睡眠肽，一些驗(yàn)證DSIP是主要的內(nèi)源性睡眠因子的假說(shuō)的研究便被開(kāi)展起來(lái)，人們考慮用它來(lái)治療失眠［10］，很多研究已經(jīng)證實(shí)這一想法。Delta-睡眠肽已經(jīng)被描繪成一種睡眠促進(jìn)物質(zhì)而不是一種鎮(zhèn)靜劑。

應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法和基因工程手段，通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)獲得Delta-睡眠肽將為Delta-睡眠肽的內(nèi)源性和生物合成等一系列問(wèn)題提供重要的信息，也可能會(huì)為Delta-睡眠肽的臨床應(yīng)用提供良好的發(fā)展契機(jī)，對(duì)促進(jìn)人們對(duì)于睡眠的認(rèn)識(shí)將有很大的意義，也將為患睡眠障礙的病人貢獻(xiàn)一個(gè)新致眠藥物提供了可能性。

本研究通過(guò)SOE-PCR方法擴(kuò)增到帶有腸激酶識(shí)別位點(diǎn)和DSIP九肽的編碼序列，經(jīng)酶切、連接構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-DSIP。以pEGFP-C1為模板擴(kuò)增出GFP的基因，插入pET-28a-DSIP中構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-GFP-DSIP，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得大量可溶性表達(dá)產(chǎn)物?？扇苄缘鞍捉?jīng)Ni-NTA親和層析柱純化，SDS-PAGE電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色分析，呈現(xiàn)一條帶，證明本研究成功構(gòu)建融合蛋白GFPDSIP，其純度達(dá)電泳純。

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