楊斌盛，馮亞楠，趙亞琴

（山西大學 分子科學研究所，山西 太原 030006）

HBED、EHPG分子內(nèi)氫鍵與光譜性質(zhì)

楊斌盛，馮亞楠，趙亞琴

（山西大學 分子科學研究所，山西 太原 030006）

在p H 7.4、0.1 mol·L－1Hepes條件下，由Tb3＋熒光測得Tb-EHPG條件穩(wěn)定常數(shù)logK為13.95±0. 13;EHPG與金屬離子結(jié)合后分子內(nèi)O…H－O型氫鍵斷裂而導致熒光被淬滅;HBED與金屬離子結(jié)合后分子內(nèi)N…H－O型氫鍵斷裂而導致熒光增強，熒光變化均與結(jié)合的金屬離子的原子量成反比.由此總結(jié)了稀土離子與HBED，EHPG結(jié)合的規(guī)律.并用熒光方法推斷了脫鐵伴清蛋白N-，C-端結(jié)合部位酪氨酸殘基的分子內(nèi)氫鍵類型.

氫鍵;光譜;金屬離子;伴清蛋白

0 引言

氫鍵在維持生物大分子高級結(jié)構(gòu)中發(fā)揮著重要的作用.生物大分子中的氫鍵類型主要有O－H…O，O－H…N，N－H…O和N－H…N.可由X射線晶體學、核磁光譜學和中子衍射等測定的供體和受體的空間排列來推斷［1］.轉(zhuǎn)鐵蛋白具有兩個類似但不同的結(jié)構(gòu)域，在每個結(jié)構(gòu)域中作為天然底物的Fe3＋與兩個酪氨酸的酚羥基，組氨酸的咪唑基，天冬氨酸的羧基及靠近精氨酸的碳酸根或碳酸氫根伴陰離子結(jié)合，形成穩(wěn)定的畸變八面體配合物［2－4］，但兩個結(jié)構(gòu)域與Fe3＋的結(jié)合能力、在轉(zhuǎn)運過程中的Fe3＋釋放動力學過程又明顯不同［5－8］.因此，研究轉(zhuǎn)鐵蛋白兩個金屬離子結(jié)合部位的差異具有重要意義.

N，N’-乙烯－二［2-（2-羥基苯基）甘氨酸］（EHPG）和 N-N’-二（2-羥芐基）乙二胺-N，N’-二乙酸（HBED）的分子結(jié)構(gòu)如圖1所示，具有不同的分子內(nèi)氫鍵.由于它們具有與轉(zhuǎn)鐵蛋白相似的金屬離子結(jié)合性質(zhì)而被作為模擬金屬離子和轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的小分子，本研究組使用紫外差光譜方法先后研究了多種稀土離子與EHPG、HBED的結(jié)合性質(zhì)［9－17］.本文基于EHPG、HBED與Tb3＋結(jié)合后對Tb3＋熒光的敏化效應(yīng)，用螯合劑競爭法測定了Tb-EHPG的條件穩(wěn)定常數(shù)，總結(jié)了EHPG、HBED與稀土離子結(jié)合的規(guī)律，分析了EHPG、HBED分子內(nèi)氫鍵與其熒光性質(zhì)的關(guān)系，探究了伴清蛋白兩個金屬離子結(jié)合部位的分子內(nèi)氫鍵的差異.

圖1 EHPG （a），HBED （b）的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of EHPG （a），HBED （b）

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

N，N’-乙烯－二［2-（2-羥基苯基）甘氨酸］（EHPG），N，N’-二（2-羥芐基）乙二胺-N，N’-二乙酸（HBED），N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（Hepes），乙二胺四乙酸（EDTA），無機鹽等均為分析純.脫鐵伴清蛋白（apoOTf）為Sigma產(chǎn)品.稀土氧化物（99.9%）為湖南稀土研究所產(chǎn)品.

Hewlett Packard 8453 UV-Vis吸收光譜儀、Perkin Elmer LS-50B熒光光譜儀、Beckman酸度計.

1.2 實驗方法

1.2.1 儲備液的配制

EHPG、HBED溶液的制備：稱取適量的樣品，加入去離子水溶解、定容，其濃度的確定使用絡(luò)合滴定法，以標準鋅溶液為滴定劑，二甲酚橙為指示劑，在p H5.5的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液中分別用EHPG、HBED溶液滴定至溶液由粉紅色變成黃色.

伴清蛋白按照前文［4］所述方法準備并通過測定280 nm處的紫外吸收確定其濃度.

稀土離子溶液的配制：稱取一定量的稀土氧化物，用一定體積的鹽酸溶解，用蒸餾水稀釋到p H＝4.0，儲備液的標定用絡(luò)合滴定法來滴定，EDTA為滴定劑，二甲酚橙為指示劑.

1.2.2 光譜測定

紫外差光譜使用1 cm石英吸收池在Hewlett Packard 8453光譜儀上測定.金屬離子滴定過程中，保持樣品在25℃水浴中.為了消除滴定過程中的稀釋效應(yīng)、比較不同滴定數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)處理中均將吸收強度除以EHPG或HBED的濃度，轉(zhuǎn)化成摩爾吸收強度.

熒光光譜使用1 cm熒光池在Perkin Elmer LS-50B熒光光譜儀上測定.由于EHPG、HBED與金屬離子有很強的結(jié)合能力，為了避免實驗過程中金屬離子污染，所有的玻璃容器、吸收池等用1 mol·L－1的硝酸浸泡，然后用蒸餾水沖洗.

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外差光譜

微酸性Tb（III）滴定HBED時，其紫外差光譜如圖2A（P315）所示.可見在238 nm和291 nm處出現(xiàn)兩個正吸收峰，270 nm處有一個負吸收峰.源于HBED與Tb3＋結(jié)合時酚羥基參與配位，使得HBED的芳環(huán)受到微擾，從而影響π→π＊躍遷.由圖2A可見，隨著Tb3＋的滴加，238 nm和291 nm處的吸收峰逐漸增高，且在256和278 nm處有等吸收點.當加入的Tb3＋達到一定量后，238 nm和291 nm處的吸收峰停滯于某一最大值.為了便于不同滴定數(shù)據(jù)的對比以及消除每次滴定所引起的稀釋效應(yīng)，將238 nm處的吸光度轉(zhuǎn)化為以HBED濃度表示的表觀摩爾吸光度（Δε）.以表觀摩爾吸光度（Δε）對Tb3＋與HBED的摩爾比作圖，如圖2A插圖所示.可見，滴定曲線初始部分的表觀摩爾吸光度線性增加，意味著滴加的Tb3＋100% 地與HBED結(jié)合，Tb-HBED的ΔεTb值為（1.63±0.11）×104cm－1·mol－1·L.在［Tb3＋］／［HBED］＝1附近有明顯的拐點，表明Tb3＋和HBED形成了1∶1的穩(wěn)定配合物.

微酸性Tb3＋滴定EHPG時，其紫外差光譜如圖2B（P315）所示，與滴定HBED所產(chǎn)生的紫外差光譜非常相似.由滴定曲線（圖2B插圖）可得Tb3＋與EHPG形成1∶1穩(wěn)定配合物，Tb-EHPG的ΔεTb值為（1.55±0.17）×104cm－1·mol－1·L.

2.2 熒光光譜

在p H ＝7.4、0.1 mol·L－1Hepes及室溫條件下，Tb3＋滴定EHPG的熒光光譜如圖3A（P315）.由圖可見，EHPG的熒光發(fā)射峰位于310 nm附近，隨著Tb3＋的加入EHPG熒光峰被淬滅，當Tb3＋達到一定量時，熒光強度不再發(fā)生明顯的變化.由于Tb3＋的5D4到7F6，7F5之間的f→f躍遷，490 nm和545 nm處出現(xiàn)Tb3＋的熒光峰.將310 nm和545 nm處熒光強度分別轉(zhuǎn)化為摩爾熒光強度（FM），并對Tb3＋與EHPG的摩爾比（r）作圖，結(jié)果如圖3B所示.由圖可見隨著Tb3＋濃度增大，310 nm處摩爾熒光強度（FM）線性減小，由于EHPG和Tb3＋之間存在分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移，545 nm處摩爾熒光強度（FM）線性增加（其熒光強度為游離鋱熒光強度的104倍），在r＝1.0附近出現(xiàn)明顯拐點，當r＞1.0時，表觀摩爾熒光強度（FM）不再隨r的增加而發(fā)生變化，進一步說明Tb3＋與EHPG形成1∶1配合物，與紫外差光譜的結(jié)論一致.

圖2 Tb3＋滴定HBED（A）和EHPG（B）的紫外差光譜Fig.2 Difference UV spectra produced from the addition of Tb（III）to HBED （A）and EHPG （B）

圖3 Tb（III）滴定EHPG的熒光光譜（A）和滴定曲線（B）Fig.3 Fluorescence spectra（A）and titration curves produced by the addition of Tb（III）to EHPG in 0.1 mol·L－1 Hepes at p H 7.4 with excitation at 280 nm

圖4（P316）為相同實驗條件下Tb3＋滴定HBED溶液的熒光光譜（A）和滴定曲線（B），可見HBED在318 nm處出現(xiàn)最大熒光峰，逐漸滴加Tb3＋溶液時，318 nm處HBED的熒光峰和Tb3＋在490 nm、545 nm處的特征熒光均有不同程度的增加，當Tb3＋達到一定量時熒光強度不再發(fā)生明顯變化.滴定曲線（B）表明Tb3＋與HBED形成1∶1穩(wěn)定配合物，Tb（III）的結(jié)合使HBED在318 nm處的摩爾熒光增強40%，Tb3＋的熒光被敏化2×104倍.

2.3 摩爾熒光強度

Tb3＋與其他二價堿金屬離子（尤其鈣離子）相似，常應(yīng)用為生物大分子結(jié)構(gòu)研究的探針，通過能量轉(zhuǎn)移可觀察到給體熒光淬滅，Tb3＋熒光增強.圖3中可以看出Tb-EHPG在545 nm處熒光增強，310 nm處熒光猝滅.圖5（A）（P317）是p H 7.4條件下Zn2＋，Y3＋，La3＋，Lu3＋滴定EHPG時310 nm處熒光強度的變化，可見這些金屬離子均可與EHPG結(jié)合形成穩(wěn)定的1∶1配合物，金屬離子結(jié)合使EHPG熒光被淬滅，淬滅程度如表1（P316）.

圖4 Tb（III）滴定HBED溶液的熒光光譜（A）和滴定曲線（B）Fig.4 Fluorescence spectra（A）and titration curves（B）for the addition of Tb3＋to an aqueous solution of HBED in 0.1 mol·L－1 Hepes at p H 7.4 with excitation at 280 nm

Zn2＋，Y3＋，La3＋，Lu3＋為閉殼層電子結(jié)構(gòu)，在芳香發(fā)光基團和金屬離子之間沒有能量轉(zhuǎn)移.EHPG在p H10.1時的熒光強度只有p H 7.4時的20%.p H 7.4時，EHPG的酚羥基完全質(zhì)子化，p H 10.1時，EHPG的酚羥基完全去質(zhì)子化［18］，310 nm處的熒光強度減弱是由于稀土離子對質(zhì)子的取代.結(jié)合鋅的EHPG熒光強度只有輕微的減少，310 nm處EHPG摩爾熒光強度只減少了10.3%.可能是EHPG酚羥基以質(zhì)子化形式與鋅配位［18］.Tb3＋的電子構(gòu)型是f8.Tb-EHPG在310 nm 處的熒光強度比 Y，Lu，La-EHPG小是由于EHPG的芳香發(fā)光團和Tb3＋之間發(fā)生分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移.

表1 p H 7.4時配合物 Mn＋-EHPG和 Mn＋-HBED的摩爾熒光強度Table 1 Molar fluorescence intensities of Mn＋ -EHPG and Mn＋ -HBED complexes at p H 7.4

HBED與Tb3＋的結(jié)合使Tb3＋在545 nm處熒光增強（圖4A），同時HBED在318 nm處熒光也有微弱的增強（圖4B）.然而按照能量轉(zhuǎn)移理論，受體（Tb3＋）熒光敏化必然伴隨有給體（HBED）熒光淬滅.為此，本文觀察了其它閉殼層金屬離子結(jié)合對 HBED熒光的影響.圖5（B）（P317）是p H 7.4條件下Al3＋，Zn2＋，Ga3＋，Y3＋，La3＋，Lu3＋，Cd2＋滴定 HBED時318 nm處熒光強度的變化，可見這些金屬離子均可與 HBED結(jié)合形成穩(wěn)定的1∶1配合物，不同金屬離子的結(jié)合使HBED 318 nm處熒光有不同的增強（表1）.由于N…H－O型分子內(nèi)氫鍵的破壞，使得318 nm處的熒光強度增強到157%～586%.將不同金屬離子與HBED結(jié)合后318 nm處熒光增強對金屬原子量作圖如圖6（P317）所示.

圖5 p H 7.4，0.1 mol·L－1 Hepes時EHPG（A）310 nm和HBED（B）318 nm處的熒光強度隨結(jié)合金屬離子的變化Fig.5 Effect of metal ion binding on the fluorescence intensity of EHPG at 310 nm （A）and HBED at 318 nm （B）in 0.1 mol·L－1 Hepes at p H 7.4

由圖6可見，Mn＋-HBED 318 nm處熒光增強隨金屬原子量的變化呈線性關(guān)系，Al3＋，Zn2＋，Ga3＋，Y3＋，Cd2＋結(jié)合而導致的熒光增強隨金屬原子量的增加線性減小;Y3＋，La3＋，Lu3＋結(jié)合而導致的熒光增強也隨金屬原子量的增加線性減小，Tb3＋結(jié)合而導致的熒光增強明顯偏離線性.表明Tb3＋結(jié)合對HBED熒光的影響有兩個方面：破壞N…H－O型分子內(nèi)氫鍵而使HBED熒 光 增 強［13］;芳 環(huán) 到 Tb3＋的 能 量 轉(zhuǎn) 移 使HBED熒光被淬滅.

2.4 結(jié)合常數(shù)

Tb3＋在游離狀態(tài)只有微弱的熒光，與配體結(jié)合置換配位水導致Tb3＋熒光有一定的增強，如EDTA可使Tb3＋熒光增強2～3倍;當配體中含有芳香環(huán)時Tb3＋熒光增強可達104倍，如HBED和EHPG（圖3和圖4）.因此，在Tb3＋、HBED或EHPG、EDTA的多元體系中所測得的Tb3＋熒光源于Tb-HBED或Tb－EHPG，Tb3＋、Tb-EDTA 對所測得的 Tb3＋熒光的貢獻可忽略不計.按照紫外差光譜測定稀土離子與HBED或EHPG結(jié)合常數(shù)的方法［9－15］，使用EDTA為競爭配體，通過測定Tb3＋545 nm處熒光可得到Tb3＋與EHPG結(jié)合的條件穩(wěn)定常數(shù)logK為13.95±0.13.相同方法得到的Tb-HBED條件穩(wěn)定常數(shù)與紫外差光譜測得的結(jié)果一致.表2是本實驗室使用紫外差光譜［9－17］、Tb3＋545 nm處熒光測得的各種稀土離子與EHPG、HBED結(jié)合的條件穩(wěn)定常數(shù).由表2可見，稀土離子與EHPG、HBED結(jié)合的條件穩(wěn)定常數(shù)與稀土離子的半徑相關(guān)，離子半徑越小結(jié)合常數(shù)越大.表明稀土離子與EHPG或HBED的結(jié)合為靜電作用.

圖6 Mn＋-HBED 318 nm處熒光增強隨金屬原子量的變化Fig.6 Variation of fluorescence enhancement at 318 nm with the atomic weight（AW）of metal ions that binds to HBED in 0.1 M Hepes at p H 7.4

表2 p H 7.4時EHPG、HBED和稀土離子結(jié)合的條件結(jié)合常數(shù)Table 2 Conditional binding constant of EHPG or HBED to lanthanide ions at p H 7.4

續(xù)表2 p H 7.4時EHPG、HBED和稀土離子結(jié)合的條件結(jié)合常數(shù)Continue Table 2 Conditional binding constant of EHPG or HBED to lanthanide ions at p H 7.4

2.5 伴清蛋白與Tb3＋結(jié)合的熒光變化

在0.1 mol·L－1p H7.4的Hepes緩沖條件下，固定激發(fā)波長280 nm可觀察到伴清蛋白在340 nm處的特征熒光峰.用Tb3＋滴定伴清蛋白的滴定曲線如圖7所示.由圖7插圖可見，脫鐵伴清蛋白（apoOTf）可使Tb3＋549 nm熒光敏化105倍，而伴清蛋白（Fe2OTf）沒有敏化Tb3＋熒光效應(yīng).表明脫鐵伴清蛋白的兩個金屬離子結(jié)合部位均可結(jié)合Tb3＋，優(yōu)先占據(jù)的是脫鐵伴清蛋白N－端金屬離子結(jié)合部位［20］.由340 nm處熒光隨［Tb3＋］／［apoOTf］的變化可見，結(jié)合在脫鐵伴清蛋白N－端金屬離子結(jié)合部位的Tb3＋使蛋白質(zhì)熒光淬滅，而結(jié)合在C－端金屬離子結(jié)合部位的Tb3＋使蛋白質(zhì)熒光增強.由此可推斷脫鐵伴清蛋白N－端結(jié)合部位的Tyr92、Tyr191與其它氨基酸殘基之間存在N…H－O型分子內(nèi)氫鍵，而C-端結(jié)合部位的Tyr431、Tyr524與其它氨基酸殘基之間存在N…H－O型分子內(nèi)氫鍵.晶體結(jié)構(gòu)也顯示在轉(zhuǎn)鐵蛋白的Tyr92和S122位之間有O…H－O型分子內(nèi)氫鍵［21］.

圖7 Tb3＋滴定伴清蛋白340 nm和549 nm熒光強度隨［Tb3＋］／［apoOTf］的變化Fig.7 Variation of fluorescence intensities at 340 nm and 549 nm with［Tb3＋ ］／［apoOTf］in 0.1 mol·L－1 Hepes，p H 7.4，λex＝280 nm

3 結(jié)論

在p H 7.4，0.1 mol·L－1Hepes條件下，HBED和EHPG均可與Tb3＋結(jié)合形成1∶1的穩(wěn)定配合物并使Tb3＋熒光敏化104倍，由Tb3＋熒光測得Tb-EHPG條件穩(wěn)定常數(shù)logK為13.95±0.13，稀土離子與HBED或EHPG的結(jié)合為靜電作用.由于HBED和EHPG的分子內(nèi)氫鍵不同，Tb3＋的結(jié)合使HBED的熒光增強，而EHPG的熒光淬滅;其它閉殼層離子 Al3＋，Zn2＋，Ga3＋，Y3＋，Cd2＋，La3＋，Lu3＋與 HBED和EHPG結(jié)合的熒光滴定表明：HBED分子內(nèi)N…H－O的斷裂導致熒光增強，EHPG分子內(nèi)O…H－O的斷裂導致熒光淬滅，熒光變化均與金屬離子的原子量成反比.脫鐵伴清蛋白N-端結(jié)合部位的Tyr92、Tyr191為O…H－O型分子內(nèi)氫鍵，而C－端結(jié)合部位的Tyr431、Tyr524為N…H－O型分子內(nèi)氫鍵.

［1］Dingey A J，Cordier F，Grzesiek S.An Introduction to Hydrogen Bond Scalar Couplings［J］.ConceptsMagnReson，2001，13：103-127.

［2］Harris W R，Yang B S，Abdollahi S，etal.Steric Restrictions on the Binding of Large Metal Ions to Serum Transferring［J］.JInorgBiochem，1999，76：231-242.

［3］楊斌盛，白海靜，劉文，等.溫度對鋱（III）轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液構(gòu)象的影響［J］.化學學報，2002，60（4）：737-743.

［4］Yang B S，Li Y Q.Binding Constants for Terbium with Chicken Apoovotransferrin［J］.ChemResChineseUniv，2001，17：6-13.

［5］白海靜，劉文，楊斌盛.酒石酸脫除單鋱轉(zhuǎn)鐵蛋白鋱（III）的熒光動力學研究［J］.化學學報，2002，60（7）：1253-1257.

［6］Li Y Q，Yang B S.Aluminum Ion Removal from Monoaluminum Ovotransferrin by Pyrophosphate［J］.ChineseJChem，2004，22：1153-1157.

［7］Yang B S，F(xiàn)eng J Y，Li Y Q，etal.Spectral Studies on Aluminum Binding to the Ligands with Phenolic Group（s）：Implications for the Differences Between N-and C-terminal Binding Sites of Human Serum Apotransferrin［J］.JInorgBiochem，2003，96：416-424.

［8］Harris W R，Wang Z，Brook C，etal.Kinetics of Metal Ion Exchange between Citric Acid and Serum Transferrin［J］.InorgChem，2003，42，5880-5889.

［9］白海靜，劉文，楊斌盛.La（III）、Eu（III）與 HBED配合的紫外差光譜研究［J］.無機化學學報，2001，17（3）：389-394.

［10］王金鈴，楊斌盛.Yb（III）、Gd（III）與EHPG配合物的光譜研究［J］.無機化學學報，2002，18（6）：577-581.

［11］李英奇，白海靜，楊斌盛.EHPG與鋁（III）結(jié)合的光譜研究［J］.光譜學與光譜分析，2002，22（3）：433-435.

［12］豐九英，楊斌盛.Lu（III）與 HBED、EHPG結(jié)合的光譜研究［J］.中國稀土學報，2002，20（6）：580-583.

［13］王金鈴，趙亞琴，楊斌盛.HBED與鋁（III）結(jié)合的光譜特性［J］.山西大學學報：自然科學版，2003，26（2）：95-99.

［14］王金鈴，畢和平，楊斌盛.紫外差光譜測定Gd3＋、Yb3＋與HBED配合物的條件穩(wěn)定常數(shù)［J］.光譜學與光譜分析，2005，25（1）：89-91.

［15］Zhao Y Q，Yang B S.Spectral Studies on the Interaction Between Lanthanum Ion and the Ligand：N，N’-ethylenebis-［2-（o-hydroxyphenolic）glycine］［J］.SpectrochimActaA，2005，62：641-644.

［16］Wang Z J，Yang B S.UV and Fluorescence Spectral Changes Induced by Neodymium Binding of N，N’-ethylenebis-［2-（ohydroxyphenolic）glycine］and N，N’-di（2-hydroxybenzyl）ethylenediamine-N，N’diacetic acid［J］.SpectrochimActa A，2006，65：946-949.

［17］Duan L，Zhao Y Q，Yang B S.Spectral Studies on the Interaction of Yttrium Ion with the Ligands of Phenolic Groups：N，N’-ethylenebis［2-（o-hydroxyphenolic）glycine］and N，N’-di（2-hydroxybenzyl）ethylenediamine-N，N’-diacetic acid［J］.SpectrochimActaA，2007，68（1）：165-168.

［18］L’Eplattenier F，Murase I，Martell A E.New Multidentate Ligands.IV.Chelating Tendencies of N，N’-di（2-hydroxybenzyl）-ethylenediamine-N，N’-diacetic acid［J］.JAmChemSoc，1967，89：837-843.

［19］趙靜，田燕妮，楊斌盛.Eu（III）與EHPG配合反應(yīng)的循環(huán)伏安特性和光譜研究［J］.化學通報，2007，70（4）：304-308.

［20］楊斌盛，Harris W R.稀土離子與伴清蛋白結(jié)合的光譜研究［J］.高等學?；瘜W學報，1998，19（7）：1057-1061.

［21］Mizutani K，Mikami B，Hirose M.Domain Closure Mechanism in Transferrin：New Viewpoints About the Hinge Structures of Ovotransferrin N-lobe［J］.JMolBiol，2001，309：937-947.

Spectral Study on the Intramolecular H-Bonds of HBED and EHPG

YANG Bin-sheng，F(xiàn)ENG Ya-nan，ZHAO Ya-qin
（InstituteofMolecularScience，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

N，N’-ethylenebis［2-（o-hydroxyphenolic）glycine］（EHPG）N，N’-di（2-hydroxybenzyl）ethylenediamine-N，N’-diacetic acid （HBED）are two ligands which have the same molecular weight but have different structures.In 0.1 mol·L－1N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid（Hepes）at p H 7.4，by measuring the fluorescence intensities at 545 nm of Tb3＋，we get the conditional binding constants of Tb-EHPG logK＝13.95±0.13.EHPG and HBED have different types of intramolecular H-bonds，so the effects of metals binding on their fluorescence are very different，the former’s is decrease while the latter’s is increase，but the same is that all fluorescence change is an inverse of metal ion’s atomic weight.In this paper，we obtain the regular patterns of lanthanide ions binding EHPG and HBED，and the intramolecular H-Bond types of apoovotransferrin in N-terminal and C-terminal binding site are inferred by fluorescence methods.

hydrogen bond;spectra;metal ions;apoovotransferrin

O641

A

0253-2395（2012）02-0313-07＊

2011-09- 05;

2011-11-25

國家自然科學基金（ 20371031;20901048）;高等學校博士學科點專項科研基金（20091401110007）

楊斌盛（1957－），男，山西應(yīng)縣人，教授，從事生物無機化學研究工作.E-mail：yangbs＠sxu.edu.cn