裴雁曦，龔澤華，李亞偉，喬增杰，穆遙

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

一株擬南芥鎘敏感突變體的篩選及表型分析

裴雁曦，龔澤華，李亞偉，喬增杰，穆遙

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

利用不同濃度梯度的CdCl2對擬南芥Col-0生態(tài)型進行處理，確定了篩選鎘敏感突變體的適合濃度為90 μmol／L.以鎘對幼苗根長生長抑制程度為指標，對擬南芥化學(xué)誘導(dǎo)激活標簽（XVE）T-DNA插入突變體庫種子進行篩選.首先在不含有雌激素的1／2 MS培養(yǎng)基進行大規(guī)模篩選，挑選根長抑制明顯的植株，單株收取種子.在T3代復(fù)篩過程中用含有濃度為90μmol／L CdCl2的1／2 MS固體培養(yǎng)基篩選到一株敏感突變體csr-2.并進行了雌二醇誘導(dǎo)過表達表型驗證.運用TAIL-PCR技術(shù)確定該植株的T-DNA插入位點位于At2g36130，并對該基因的序列進行了初步的生物信息學(xué)分析.

擬南芥;突變體篩選;T-DNA插入突變體;鎘

隨著工業(yè)化的迅速發(fā)展，人類賴以生存的土壤受到重金屬的嚴重危害，威脅人類健康.重金屬污染已經(jīng)成為全球面臨的環(huán)境問題［1］.鎘（Cd）是生物毒性最強的重金屬元素，居五種重金屬Cd、Hg、Pb、Cr、As污染之首［2］，作為一種非必須元素，即使在低濃度下也會對植物根的生長造成影響［3］.鎘污染周期長、移動快、毒性高、難降解，被鎘污染的土壤會對植物生長發(fā)育、膜系統(tǒng)、根系、光合作用造成傷害［4］.因此研究鎘污染是當(dāng)下急需解決的環(huán)境問題之一［5］.

擬南芥（Arabidopsisthaliana）作為一種基因組背景清晰的模式生物，具備生長周期短，基因組小等優(yōu)點，是非常方便的基因功能研究材料［6］.

雌激素激活標簽（XVE）系統(tǒng)是一種嚴格依賴于雌激素作為誘導(dǎo)的激活系統(tǒng)，可通過雌激素的用量嚴格控制下游基因的表達水平，并產(chǎn)生顯性功能獲得型突變，從而克服了不能篩選鑒定植物生長發(fā)育中的關(guān)鍵基因和一些功能冗余基因的問題［7］，這些特點使得其成為篩選突變體有力工具.此外，T-DNA在擬南芥、水稻基因組中的插入方式已被證實，其插入位點是隨機的，而且整合的拷貝數(shù)較低，被插入的基因在后代中能夠穩(wěn)定遺傳［8］.在擬南芥中已經(jīng)建立了接近飽和的T-DNA插入突變體庫［9］.該突變體庫具有可被特異誘導(dǎo)物高度誘導(dǎo)、特異激活目標基因［10］的特點.利用這一系統(tǒng)構(gòu)建的擬南芥突變體庫在大規(guī)模篩選鑒定功能缺失性和功能獲得性突變體的研究中優(yōu)勢明顯，目前已經(jīng)利用該系統(tǒng)得到鹽耐受［11］、草酸敏感等相關(guān)突變體［12］.

國內(nèi)外關(guān)于植物對Cd的響應(yīng)及其調(diào)控機理均圍繞Cd誘導(dǎo)植物抗氧化系統(tǒng)、硫代謝和Cd跨膜轉(zhuǎn)運開展研究，分子機制方面的研究有待進一步深入.本實驗室使用XVE系統(tǒng)T-DNA插入突變體庫進行了大規(guī)模篩選，并獲得了大量Cd響應(yīng)突變體.希望通過對擬南芥鎘敏感突變體的篩選和分析，得到與其相關(guān)的突變基因，以期進一步了解高等植物中Cd響應(yīng)的分子機制.本文就其中一株Cd敏感突變體的篩選和鑒定進行研究.

1 材料和方法

1.1 實驗材料和培養(yǎng)條件

以擬南芥Col-0生態(tài)型、XVE擬南芥突變體庫為材料（由中國科學(xué)院遺傳發(fā)育所提供）.23℃、100μmol·m－2·s－1光照、16 h光照／8 h黑暗的光周期條件下培養(yǎng).

1.2 篩選濃度的確定

先將野生型和突變體種子于4℃黑暗條件下春化3 d，70%乙醇消毒40 s，再用質(zhì)量濃度5%次氯酸鈉處理5～7 min，無菌水漂洗3次，播種于CdCl2濃度梯度為0、30、60、90、120、150μmol／L的1／2 MS培養(yǎng)基中.兩周后，觀察不同鎘濃度對植株根生長的影響情況，確定篩選敏感突變體的適合濃度.

1.3 突變體的篩選

突變體庫種子表面滅菌后，播種于含有CdCl2的1／2 MS固體培養(yǎng)基.兩周后，挑選根長受到明顯抑制的候選敏感突變體，移入無Cd的1／2 MS固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5 d后再移入土中，單株采種.將T3代種子按株系分別播種在1／2 MS、含Cd Cl2的1／2 MS、含雌二醇和CdCl2的1／2 MS固體培養(yǎng)基進一步驗證表型.

1.4 T-DNA插入位點鑒定

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選濃度的確定

用不同濃度的CdCl2處理樣品，篩選結(jié)果（圖1）表明，14 d后，與對照植株相比，Cd濃度為90μmol／L時植株根長受到了一定程度的抑制，而濃度為120μmol／L時根長生長受到完全抑制，因此，確定90μmol／L為Cd敏感突變體的適合篩選濃度.

圖1 野生型Col-0在不同鎘濃度梯度下根的生長情況Fig.1 Growth situation status of Col-0 in MS media with different concentration of Cd2＋

2.2 鎘敏感突變體的篩選

將突變體種子播于含有90μmol／L Cd Cl2的1／2 MS固體培養(yǎng)基進行篩選.以14 d后的根長作為初篩標準.初篩共選出約11株有鎘敏感表型的突變體，兩周之后移栽到土里，單株采種.為避免假陽性，以相同方法對每個株系進行復(fù)篩，獲得3株表型穩(wěn)定的突變體，分別命名為csr-1、csr-2、csr-3.為確認這些突變體的敏感表型是T-DNA的插入所致，將csr-1、csr-2、csr-3單株收取的種子分別播種在含有90μmol／L CdCl2的1／2 MS固體培養(yǎng)基和同時含有雌激素以及90μmol／L CdCl2的1／2 MS固體培養(yǎng)基，以野生型為對照.結(jié)果表明，與野生型植株生長情況相比，只有csr-2植株的敏感表型會被雌激素的誘導(dǎo)完全恢復(fù)最終確認csr-2植株是一株純和的鎘敏感T-DNA插入突變體，其表型數(shù)據(jù)如圖2（P402）所示，野生型和突變體在含有90 μmol／L Cd Cl2的1／2 MS培養(yǎng)基中根長分別為1.5 cm和0.5 cm，而加入雌激素后突變體csr-2根長恢復(fù)至1.4 cm，與野生型根長相比幾乎沒有變化.

圖2 突變體csr-2在Cd脅迫下的表型分析（用90μmol／L CdCl2 以及90μmol／L CdCl2＋雌激素處理csr-2，觀察突變體生長情況及測量其根長，以90μmol／L CdCl2處理WT作為對照）Fig.2 Phenotype analysis of csr-2 with Cd treatment.Growth status and root length of csr-2 was determined in the condition of 90μmol／L Cd2＋ with estrogen or not.WT treated with 90 Cd as control.Values are means±SE（n＝10）.Values with＊indicate significant differences（P＜0.05）among them

2.3 csr-2插入位點分析和鑒定

對csr-2突變體進行TAIL-PCR分析（圖3a，P403），將所獲得的片段回收后克隆于p MD18-T載體酶切驗證（圖3b）后進行測序.序列結(jié)果如下：

其中波浪線代表T載體，直線代表T-DNA區(qū)，無標記表示擬南芥DNA序列.

NCBI（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi ）Blast比對表明：該突變體的T-DNA插入位點為At2g36130第六個外顯子上，位于該基因的1 432 bp和1 583 bp之間（圖4a，P403）.數(shù)據(jù)庫查詢顯示尚無該基因與重金屬響應(yīng)關(guān)系的報道.將突變體和野生型中該基因的表達情況進行RT-PCR分析，結(jié)果顯示該基因表達量在突變體中顯著下調(diào)（圖4b）.

3 討論

親環(huán)蛋白（cyclophilin，CyP）家族屬于具有催化含脯氨酸的寡肽底物順反異構(gòu)作用的肽脯氨酰順反異構(gòu)酶（peptidyl-prolyl cis-trans isomerases，PPIase）［14］，是一類廣泛存在于原核和真核生物體內(nèi)，并在結(jié)構(gòu)上高度保守的多功能蛋白質(zhì).有研究報道，親環(huán)素能夠參與植物的脅迫應(yīng)答反應(yīng)，馬鈴薯親環(huán)素作為催化肽脯氨酸順反異構(gòu)酶參與了許多脅迫作用的防衛(wèi)反應(yīng)［15］.親環(huán)素還能調(diào)節(jié)蛋白磷酸酶2A的活性，從而調(diào)節(jié)細胞循環(huán)、蛋白質(zhì)缺乏、反轉(zhuǎn)錄、生長和發(fā)育的許多信號途徑［16］.此外，親環(huán)素具有多種生物學(xué)功能，其中2種研究得最為透徹.一種是與Cs A結(jié)合形成Cy P-Cs A復(fù)合體，在人體中通過鈣調(diào)磷酸酶抑制免疫反應(yīng);另外一種是具有肽酰脯氨酸順／反異構(gòu)酶（PPIase）活性，能夠催化蛋白質(zhì)特別是富含脯氨酸的蛋白質(zhì)折疊，同時起著分子伴侶的作用［17］.

圖3 csr-2突變體的Tail-PCR與酶切鑒定（a）第1泳道為第一次PCR產(chǎn)物，2為第二次PCR產(chǎn)物，3為第三次PCR產(chǎn)物且箭頭所指為目的條帶（b）目的條帶與T載體連接后的重組質(zhì)粒酶切驗證（Bam H I和HindⅢ）Fig.3 （a）Tail-PCR to amplify the T-DNA franking sequence of mutant csr-2.Lane 1：first product;Lane 2：secondary product;Lane 3：tertiary product;the arrowhead indicate the target sequences.（b）Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion（Bam H I和 Hind Ⅲ）

圖4（a） T-DNA的插入位點及（b）RT-PCR分析突變體基因表達量矩形代表外顯子，直線代表內(nèi)含子Fig.4 （a）Schematic representation of T-DNA insertion site in the mutant.The lines represent introns and rectangles represent exons，respectively.The position of the T-DNA insertion in At2g36130 is indicated by a triangle（not to scale）.（b）RT-PCR analysis of expression of At2g36130 transcripts in wild type（WT）and csr-2

NCBI數(shù)據(jù)庫blast結(jié)果顯示，At2g36130基因編碼肽酰脯氨酰順反式異構(gòu)酶，因此屬于cyclophilins family（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi ）.相關(guān)文獻報道擬南芥中肽酰脯氨酰順反式異構(gòu)酶包含4個結(jié)構(gòu)上區(qū)分的家族：親環(huán)素家族（cyclophilins），F(xiàn)K506結(jié)合蛋白家族（FK506-binding proteins），微小菌素家族（parvulins），和蛋白磷酸酶2A催化家族（PP2A phosphatase activator）［18］.該酶能夠?qū)⒁愿彼衢_頭的肽鏈由順式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成反式結(jié)構(gòu)，這種構(gòu)象變化降低了蛋白質(zhì)折疊所需的能量［19］，而且此過程對于蛋白質(zhì)正確折疊意義重大.利用Protparam tool軟件（http：／／web.expasy.org／cgi-bin／protparam／protparam）對其翻譯的蛋白理化性質(zhì)進行分析得知：相關(guān)蛋白總共含有164個氨基酸，分子式為C801H1268N230O243S7，分子質(zhì)量為18 232.6.其二級結(jié)構(gòu)各主要組分所占比例為：Helix＝12.2%，Strand＝31.1%，Loop＝56.7%，而且現(xiàn)有的預(yù)測結(jié)果表明植物中與其相關(guān)的蛋白質(zhì)存在于葉綠體中的可能性較大（https：／／www.predictprotein.org／get＿results.php？req＿id＝284880）.

目前關(guān)于親環(huán)素家族成員與植物重金屬脅迫響應(yīng)的關(guān)系還少見報道.對于scr-2突變體生理生化及分子機制的研究正在進行中.

致謝：衷心感謝中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所左健儒研究員提供擬南芥突變體庫.

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Isolation and Phenotype Analysis of A Cd Sensitive Mutant ofArabidopsisthaliana

PEI Yan-xi，GONG Ze-hua，LI Ya-wei，QIAO Zeng－jie，MU Yao
（SchoolofLifeScience，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

We determined 90μmol／L CdCl2as concentration of screening Cd-sensitive mutant by a concentration gradient assay with Arabidopsis thaliana Col-0.According to the effect of Cd2＋on root growth，seeds from an Arabidopsis mutant library which is characteristic by XVE system were screened.In the process of screening，mutants were firstly screened in 1／2 MS without estrogen，and then the seeds of mutant with better root growth were collected individually.In the second screening of T3，the mutant namedcsr-2 was identified by the measure of treating with 90μmol／L Cd2＋，and validated by over-expression induce of estrogen.Finally，the insertion site ofcsr-2 was located at At2g36130 by ail-PCR，and bioinformatics analysis of the gene sequences was conducted initially.

Arabidopsisthaliana;mutant isolation;T-DNA insertion mutant;Cd

O943

A

0253-2395（2012）02-0400-05＊

2012-01- 11;

2012-03-06

回國留學(xué)人員項目（2011-007）;教育部博士點（博導(dǎo)類）項目（20091401110004）;高等學(xué)校優(yōu)秀青年學(xué)術(shù)帶頭人支持計劃（TYAL）

裴雁曦（1970－），男，山西渾源人，博士，教授，主要研究方向為植物分子遺傳學(xué).E-mail：peiyanxi＠sxu.edu.cn