侯佩強(qiáng) 楊冬芳 張榮強(qiáng) 王娟娟 牟福生 楊會(huì)利

(泰安市疾病預(yù)防控制中心，山東 泰安 271000)

2006年以來，隨著泰安市外來婚嫁女等人群專題調(diào)查工作的深入開展，全市疫情呈現(xiàn)了較快增長(zhǎng)的勢(shì)頭，從2004年報(bào)告首例外來婚嫁女感染者到2010年底，其感染人數(shù)已占全市疫情總數(shù)的15.75%，成為全市艾滋病感染率較高的人群之一，其中8名外來婚嫁女的丈夫感染了HIV，3例發(fā)生了母嬰垂直傳播，給感染者家庭和群眾健康造成了嚴(yán)重的危害，外來婚嫁女及其配偶子女感染已成為我市近年來艾滋病疫情快速增長(zhǎng)的主要原因之一。根據(jù)本地的疫情狀況，我們采用RT-PCR的方法，測(cè)定了泰安市部分外來婚嫁女gag和env基因序列，比較本地區(qū)HIV在不同個(gè)體和亞型之間的基因變異性，探討其流行病學(xué)特點(diǎn)，為采取針對(duì)性的預(yù)防和控制措施提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1樣本來源 HIV抗體確認(rèn)陽性，并能夠隨防到的泰安市外來婚嫁女HIV感染者/病人的抗凝全血或血清樣本。

1.2前病毒DNA提取

用淋巴細(xì)胞分離液分離樣品的單核細(xì)胞(PBMC)，PBS洗兩遍后，使用Qiagen公司的QIAamp Blood Mini Kit試劑盒提取單個(gè)核細(xì)胞中前病毒DNA，利用promega的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。

1.3套式聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增

引物由大連寶生物公司合成。用多對(duì)引物進(jìn)行HIV-1env基因和gag基因片段的擴(kuò)增，其中，gag基因的引物為GAG-L：TCGACGCAGGACTCGGCTTGC，GAG-E2：TCCAACAGCCCTTTTTCCTAGG；GUX：AGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTC，GDX：GGCTAGTTCCTCCTACTCCCTGACAT。Env基因的引物為ED5：ATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTG，ED12：AGTGCTTCCTGCTGCTCCCA；Env7：CTGTTAAATGGCAGTCTAGC，Env8：CACTTCTCCAATTGTCCCTCA。

Env基因擴(kuò)增，第一輪反應(yīng)條件：以ED5/ED12為外側(cè)擴(kuò)增引物進(jìn)行第1輪PCR反應(yīng)，條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30～35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保溫。以E7/E8為內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，條件為：94 ℃ 2 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30～35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保溫。

Gag基因擴(kuò)增，第一輪反應(yīng)為RT-PCR，反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30～35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫;第二輪PCR反應(yīng)條件為： 94 ℃ 2 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30～35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。

1.4PCR產(chǎn)物的純化和回收

依據(jù)QIAquick Gel extraction kit 試劑盒進(jìn)行，回收的樣品DNA應(yīng)經(jīng)電泳無明顯脫位、雜帶，取5 μl PCR回收產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖100V電泳30 min，與標(biāo)準(zhǔn)分子量(Marker)比較，初步判斷樣品的濃度和質(zhì)量。用2%瓊脂糖凝膠電泳濃縮后，切下特異擴(kuò)增條帶進(jìn)行純化、回收，再用1%凝膠電泳檢測(cè)其濃度和純度。

1.5DNA序列測(cè)定

將純化后的PCR 產(chǎn)物送南京金斯特公司進(jìn)行測(cè)序，使用儀器為ABI 3730測(cè)序儀。

1.6序列分析

使用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對(duì)，然后使用MEGA 4.1軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1基因的亞型鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

HIV-1分型主要依據(jù)env區(qū)基因序列并結(jié)合gag區(qū)基因序列，與HIV-1各個(gè)亞型國(guó)際參考株比較，通過系統(tǒng)進(jìn)化分析，最后確定HIV-1病毒基因亞型[1]。T25，T26，T27，T29，T31樣本來源為泰安市外來婚嫁女。 gag區(qū)基因型分別為01AE(T26，T27，T29)，07BC(T25)和08BC(T31)；env區(qū)基因型分別為01AE(T26，T27，T29)，C(T25，T31)。因此5份泰安市外來婚嫁女樣本分屬于HIV-1型M組的三個(gè)亞型，其中3份CRF01-AE重組亞型(T26，T27，T29)，1份CRF07-BC(T25)和1份CRF08-BC(T31)。

圖1 泰安市HIV-1 gag基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖2 泰安市HIV-1 env基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2基因離散率分析

見表1，各亞型env基因的組內(nèi)基因距離及與國(guó)際參考株的基因距離均大于gag基因。

表1 不同基因區(qū)段不同亞型基因距離

3 討 論

HIV-1基因組主要由gag、env和pol這三個(gè)結(jié)構(gòu)基因以及其他調(diào)控基因所構(gòu)成，p24蛋白是由gag基因編碼產(chǎn)生的衣殼蛋白，是病毒的重要組成部分，同時(shí)其表面具有多個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)，在免疫機(jī)制中也發(fā)揮重要作用，p24蛋白的編碼區(qū)高度保守，其表位序列的變化可能導(dǎo)致免疫逃避。env基因主要編碼產(chǎn)生包膜蛋白、跨膜蛋白等多種糖蛋白，序列變異性較大，其編碼的氨基酸差異可達(dá)30%，因此env基因的序列通常被作為確定亞型的重要依據(jù)[2]。pol基因主要編碼產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶等各種酶類，也是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物作用的主要靶位。

2001-2003年進(jìn)行的第二次全國(guó) HIV 分子流行病學(xué)調(diào)查，共發(fā)現(xiàn) A、B(占2.55%)、B’(占29.11%)、C(占1.03%)、CRF-BC( CRF07- BC、CRF08- BC)、CRF01-AE(15.54%)和CRF02-AG8種類型HIV-1基因亞型，B’亞型還是分布最廣泛的 HIV-1亞型；CRF-BC(CRF07-BC和CRF08- BC)是我國(guó)HIV-1重組的主要模式,流行于全國(guó)大部分地區(qū)[3]; 通過對(duì)擴(kuò)增成功的5樣品進(jìn)行基因亞型鑒定, 發(fā)現(xiàn)外來婚嫁女感染者所攜帶的HIV-1毒株為CRF01-AE、CRF07-BC和CRF08-BC三個(gè)重組株，其中3例CRF01-AE重組亞型，1例CRF07-BC重組亞型和1例CRF08-BC重組亞型。泰國(guó)的研究顯示，CRF01-AE比泰國(guó)B亞型病毒更容易傳播，而且死亡時(shí)間比西方國(guó)家提前[4]。一項(xiàng)在中國(guó)南方四省(廣西、廣東、江西和湖南)的HIV分子流行病學(xué)調(diào)查顯示，CRF01-AE流行毒株在人群中所占比例較多，是優(yōu)勢(shì)傳播毒株，并且和越南CRF01-AE有較高的同源性，存在與越南病毒株間的多次傳播[5]。通過對(duì)這五位外來婚嫁女的流行病調(diào)查，她們的來源也和分析相符。

Stoeckli認(rèn)為，與env區(qū)8%～17%這樣較高的個(gè)體間變異率相比[6]，gag基因變異率稍低，在個(gè)體間的變異率為2.7%～5.9%。本研究結(jié)果與上述報(bào)道也一致。

影響特殊亞型和流行重組病毒的流行和傳播的因素仍然不清楚，新的亞型或重組病毒不斷在形成，并有可能成為新的流行病毒株，但是病毒變異和重組的特性是推動(dòng)艾滋病變異的主要?jiǎng)恿7]。通過對(duì)外來婚嫁女HIV亞型分析，對(duì)我市HIV的來源將有更充分的認(rèn)識(shí)，這有利于艾滋病的預(yù)防和控制，對(duì)防止二代感染也有積極的意義。

[1] 唐力，刑輝，等. 武漢市HIV-1相關(guān)基因序列分析及亞型分布[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2007,23(11)：1071.

[2] Cohen CJ, Hunt S, Sension M, et al. A randomized trial assessing the impact of phenotypic resistance testing on antiretroviral therapy[J]. Aids,2002,579-588.

[3] 劉翌．艾滋病病毒分子亞型流行病學(xué)研究進(jìn)展[J]．中國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫雜志，2006，( S1):146-150．

[4] Huang W,Eshliman SH,Toma J, er al.Coreceptor tiopism in human immunodeficiency virus type 1 subtype D ;high prevalence of CXCR4 tropism and heterogeeneous composition of viral population[J].J virol, 2007,81(15):7885-7893.

[5] Cheng CL,Fan Y,Wu SL, et al.Genetic characteristies of HIV-1CRF01-AE strains in four provinces, southern China[J].Zhonghua Liuxingbingxue Zazhi,2009,30(1):720-725.

[6] Stoeckli TC，MaWhinney S，Uy J，et al.Phenotypic and genotypic analysis of biologically cloned human immunodeficieney vuris type 1 isolates from Patients treated with zidovudine and lamivudine[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2002,46:4000-4003.

[7] 程華，鐘平.艾滋病病毒亞型及其影響[J]. 中國(guó)病毒學(xué)雜志，2011,1(2)：147-153.