任寶永, 姜 鵬 崔玉琳, 姜進(jìn)舉,3, 秦 松

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院 研究生院, 北京 100049; 3. 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003)

導(dǎo)入bar基因獲得裙帶菜草丁膦抗性配子體

任寶永1,2, 姜 鵬1, 崔玉琳1,2, 姜進(jìn)舉2,3, 秦 松1

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院 研究生院, 北京 100049; 3. 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003)

裙帶菜(Undaria pinnatifida)配子體經(jīng)2.5 L氣升式光生物反應(yīng)器快速營養(yǎng)增殖, 通過基因槍法將攜帶草丁膦抗性基因(bar)的載體轉(zhuǎn)入擴(kuò)增后的配子體, 經(jīng)草丁膦篩選, 獲得抗性克隆。提取抗性克隆配子體基因組總DNA, 經(jīng)PCR和PCR Southern檢測, 結(jié)果顯示60%的抗性克隆可檢出bar基因, 表明bar基因是裙帶菜配子體基因工程有效的篩選標(biāo)記。

裙帶菜(Undaria pinnatifida)配子體; 基因工程; 草丁膦抗性基因

裙帶菜(Undaria pinnatifida)在中國已形成規(guī)?；耘? 具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。大型海藻的基因工程研究開始于20世紀(jì)90年代, 建立了以海帶為材料的穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)[1-2]。裙帶菜與海帶同屬海帶目大型褐藻, 通過借鑒海帶的經(jīng)驗(yàn), 于道展等[3]、秦松等[4]分別實(shí)現(xiàn)了lacZ報(bào)告基因在裙帶菜孢子體中的瞬間表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá), 證明基因槍法是適合裙帶菜的有效導(dǎo)入方法, 通過在配子體階段進(jìn)行遺傳操作, 在孢子體階段進(jìn)行表達(dá)是可行的技術(shù)路線, 但尚未發(fā)展有效的選擇標(biāo)記對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。張亦陳等[5]、于道展等[6]開展了裙帶菜配子體對不同篩選試劑的敏感性試驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)對草丁膦非常敏感, 提示草丁膦可作為裙帶菜配子體遺傳轉(zhuǎn)化的篩選試劑。鑒于褐藻配子體不同品系的發(fā)育和生長速度存在較大差異[7], 作者首先利用 2.5 L生物反應(yīng)器驗(yàn)證試驗(yàn)品系的快速營養(yǎng)增殖能力,之后應(yīng)用基因槍法將草丁膦抗性基因(bar)導(dǎo)入裙帶菜配子體, 經(jīng)草丁膦篩選和PCR及PCR Southern檢測, 綜合分析bar基因作為裙帶菜配子體基因工程選擇標(biāo)記的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 裙帶菜配子體的培養(yǎng)

裙帶菜配子體品系(U2♂)由本實(shí)驗(yàn)室保存, 采用 PES培養(yǎng)液靜止培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度為 22℃, 光暗周期為14 h/10 h, 光照強(qiáng)度為1700 lx。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒載體

宿主菌為Escherichia coliTOP10菌株, 轉(zhuǎn)化所用質(zhì)粒載體為p35bar40tac, 該載體攜帶bar基因, 上游為CaMV35S啟動子, 下游為nos終止子。菌株與載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 儀器、耗材與試劑

2.5 L氣升式光生物反應(yīng)器由中國科學(xué)院過程與工程研究所試制, 基因槍轉(zhuǎn)化所用 GJ-1000高壓氣體基因槍、DNA載片、阻擋網(wǎng)、可裂膜(7MP)和金粉均為寧波新芝公司產(chǎn)品, Southern雜交所用雜交膜、地高辛DNA 標(biāo)記和檢測試劑盒購自Roche公司,質(zhì)粒小抽試劑盒購自天根公司, 植物基因組提取試劑盒購自百泰克公司。

1.2 方法

1.2.1 2.5 L氣升式光生物反應(yīng)器中增殖配子體

1.2.1.1 培養(yǎng)條件

裙帶菜配子體在2.5 L反應(yīng)器中采用PES培養(yǎng)液營養(yǎng)增殖, 培養(yǎng)溫度為 22℃, 光照強(qiáng)度為 2200 lx,通氣量為0.6 L/min, 光暗周期為14 h/10 h。

1.2.1.2 生長指標(biāo)的測定

共測量3個(gè)生長指標(biāo)：pH值、DO和葉綠素a。前兩者通過pH電極和溶氧電極檢測。由于裙帶菜配子體在培養(yǎng)過程中形成多細(xì)胞絲狀體, 不能通過測量藻體的吸光值來直接測定藻體的生長狀況, 作者借鑒采用 Porra測定葉綠素的方法來間接測定其生長速度[8]。

1.2.2 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體的制備

采用天根公司的質(zhì)粒小抽試劑盒提取高質(zhì)量的質(zhì)粒載體DNA。

1.2.3 基因槍轉(zhuǎn)化

1.2.3.1 藻體轉(zhuǎn)化前處理

利用自然沉淀的方式收集2.5 L氣升式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的配子體細(xì)胞, 使用載玻片研磨絲狀配子體至形成5～10個(gè)細(xì)胞的藻段, 避光恢復(fù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3.2 基因槍轉(zhuǎn)化

微粒子彈的制備及基因槍的轟擊按照J(rèn)iang的方法[1], 轟擊壓力7 MP, 真空度為－0.085 MP, 轟擊距離為 6 cm, 共轉(zhuǎn)化兩組樣品, 每組樣品平行轟擊 2次。

1.2.4 裙帶菜配子體的篩選和擴(kuò)增

轉(zhuǎn)化后的配子體細(xì)胞避光恢復(fù)培養(yǎng) 24 h, 之后見光恢復(fù)培養(yǎng)7 d, 培養(yǎng)條件為：溫度為22℃, 光周期14 h/10 h, 光照強(qiáng)度為1700 lx, 使用PES培養(yǎng)液。7 d后加入草丁膦篩選, 草丁膦質(zhì)量濃度為50 mg/L,持續(xù)篩選3周, 每周更換1次培養(yǎng)液。3周后更換含30 mg/L的草丁膦培養(yǎng)液, 1周后去除草丁膦恢復(fù)培養(yǎng), 60 d后取抗性克隆分別單獨(dú)培養(yǎng), 用于PCR檢測。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因裙帶菜配子體的分子檢測

利用百泰克植物基因組提取試劑盒提取抗性克隆的基因組總DNA, 設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物見表1和圖1。以提取的兩個(gè)轉(zhuǎn)化組的基因組 DNA為模板, 用 p1和p3引物PCR擴(kuò)增檢測。從兩個(gè)轉(zhuǎn)化組中各挑選一個(gè)陽性 PCR產(chǎn)物, 以其為模板, 利用 p2和 p3引物二次PCR擴(kuò)增, 將此次得到的PCR片段進(jìn)行Southern雜交。以p2和p3為引物, 從質(zhì)粒上擴(kuò)增bar基因片段, 該片段純化后以隨機(jī)引物法地高辛標(biāo)記制成探針。Southern雜交檢測方法參照 Roche公司的地高辛DNA標(biāo)記和檢測試劑盒使用說明進(jìn)行。

表1 PCR引物序列Tab. 1 Oligonucleotide sequences of primers

圖1 PCR引物與Southern雜交探針示意圖Fig. 1 Primers design for bar gene and the Southern blot

PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min, 94℃變性45 sec,54℃退火35 sec(p1/p3)或57℃退火35 sec(p2/p3), 72℃延伸1 min, 循環(huán)35次, 72℃延伸10 min。

2 結(jié)果

2.1 裙帶菜配子體在2.5 L氣升式光生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)

將配子體在2.5 L氣升式光生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng), 每天定時(shí)測量pH、溶氧(DO)和葉綠素a含量, 培養(yǎng)過程大致可以分為兩個(gè)階段：第一階段(1～5 d),培養(yǎng)基中的溶氧、pH值和葉綠素a含量變化不大, 第二階段(6～10 d), 溶氧升高, pH 值也隨之略有升高,同時(shí)葉綠素a含量逐漸增加。在整個(gè)培養(yǎng)周期中, 配子體大約擴(kuò)增了 3倍, 說明該轉(zhuǎn)基因所用品系配子體可以實(shí)現(xiàn)快速營養(yǎng)增殖(圖2)。

圖2 裙帶菜配子體在2.5 L光生物反應(yīng)器中的生長曲線及溶氧和pH變化曲線Fig. 2 The growth, variation of DO and variation of pH curve of U. pinnatifida gametophytes in 2.5L photobioreactor

2.2 草丁膦篩選

基因槍轉(zhuǎn)化后, 配子體在黑暗中恢復(fù)培養(yǎng) 24 h,之后在PES培養(yǎng)液中靜置培養(yǎng)。1周后轉(zhuǎn)入50 mg/L草丁膦溶液中篩選。發(fā)現(xiàn)配子體在草丁膦的作用下逐漸由褐色轉(zhuǎn)為綠色, 篩選 1周之后大部分配子體白化死亡, 每周更換篩選培養(yǎng)液。3周后, 將配子體轉(zhuǎn)入低劑量30 mg/L草丁膦培養(yǎng)液中恢復(fù)培養(yǎng)1周,之后將配子體轉(zhuǎn)入正常PES培養(yǎng)基中恢復(fù)生長, 約2個(gè)月后, 第一轉(zhuǎn)化組有 18個(gè)抗性克隆出現(xiàn), 第二個(gè)轉(zhuǎn)化組有15個(gè)抗性克隆出現(xiàn), 將抗性克隆分離并單獨(dú)培養(yǎng)增殖。

2.3 PCR及PCR Southern 檢測

從第一和第二轉(zhuǎn)化組中分別隨機(jī)取 12和10個(gè)抗性克隆, 提取其基因組總DNA并做PCR檢測, 利用p1和p3引物擴(kuò)增載體中間818 bp的片段。兩個(gè)轉(zhuǎn)化組均獲得抗性克隆, 第一轉(zhuǎn)化組有 6個(gè)陽性克隆(圖3), 第二轉(zhuǎn)化組有7個(gè)陽性克隆(圖4), 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如表2所示。從第一和第二轉(zhuǎn)化組中各取一個(gè)陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行二次PCR, 得到424 bp的片段, 該產(chǎn)物進(jìn)行 Southern雜交檢測, 結(jié)果顯示兩轉(zhuǎn)化組PCR Southern雜交均有陽性信號(圖5), 表明兩組抗性克隆配子體已成功轉(zhuǎn)化bar基因。

圖3 p1和p3引物PCR擴(kuò)增檢測第一轉(zhuǎn)化組Fig. 3 PCR analysis of Group 1 transformed U. pinnati fi da gametophytes genomic DNA with p1/ p3 primers

圖4 p1和p3引物PCR擴(kuò)增檢測第二轉(zhuǎn)化組Fig. 4 PCR analysis of Group 2 transformed U. pinnati fi da gametophytes genomic DNA with p1/ p3 primers

表2 陽性克隆配子體統(tǒng)計(jì)Tab. 2 Statistics of positive clones

圖5 PCR-Sourthern Blotting 檢測 bar基因(p2/p3 引物)Fig. 5 PCR-Sourthern Blotting analysis of bar gene (p2/p3 primer)

3 討論

作者以裙帶菜配子體為材料, 利用基因槍法導(dǎo)入含有bar基因的質(zhì)粒載體, 經(jīng)草丁膦篩選, 兩個(gè)轉(zhuǎn)化組分別獲得18個(gè)和15個(gè)抗性克隆, PCR檢測結(jié)果顯示, 平均陽性克隆率為60%, 結(jié)果顯示bar基因能夠賦予轉(zhuǎn)化子草丁膦抗性并在篩選壓力下存活。本文首次證明bar基因是裙帶菜基因工程有效的篩選標(biāo)記。

篩選標(biāo)記基因是藻類基因工程的重要載體元件,用于篩選成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。草丁膦抗性基因(bar)是植物基因工程常用的篩選標(biāo)記基因, 其原理是bar基因編碼PPT乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶, 能催化乙酰輔酶A與草丁膦的游離氨基結(jié)合, 使其失活[9-10]。在抗性克隆中有 40%的配子體為假陽性, 分析其中的原因,主要與配子體的生長特點(diǎn)有關(guān), 配子體是多細(xì)胞段藻體, 在生長過程中會出現(xiàn)配子體黏附一起生長現(xiàn)象, 有些會形成小的細(xì)胞團(tuán)。當(dāng)加草丁膦篩選后, 處于細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部的配子體接觸的藥物濃度劑量較低,出現(xiàn)不完全致死效應(yīng), 待恢復(fù)生長時(shí), 這些配子體會逐漸恢復(fù), 出現(xiàn)假陽性克隆, 以后的研究中可以通過每天定時(shí)搖動培篩養(yǎng)液來加以克服。

[1]Jiang P, Qin S. Expression of thelacZreporter gene in sporophytes of the seaweedLaminaria japonica(Phaeophyceae) by gametophyte-targeted transformation[J]. Plant Cell Reports, 2003, 21(12)：1211-1216.

[2]Qin S, Jiang P, Tseng C K. Transforming kelp into a marine bioreactor[J]. Trends in Biotechnology, 2005,23(5)：264-268.

[3]于道展, 秦松.β-半乳糖苷酶基因(lacZ)在大型經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜中的瞬間表達(dá)[J]. 高技術(shù)通訊, 2002, 8：93-95.

[4]秦松, 于道展, 姜鵬,等.β-半乳糖苷酶基因(lacZ)在海藻裙帶菜中的穩(wěn)定表達(dá)[J]. 高技術(shù)通訊, 2003, 7：87-89.

[5]張亦陳, 高江濤, 張喆, 等. 裙帶菜配子體基因工程選擇標(biāo)記的研究[J]. 海洋科學(xué), 2007, 12：64-68.

[6]于道展, 楊玲玲, 姜鵬. 裙帶菜基因工程選擇標(biāo)記的研究[J]. 高技術(shù)通訊, 2003, 6：74-77

[7]白逢偉, 秦松, 李永祺. 海帶絲狀雌配子體孤雌生殖的初步研究[J]. 海洋科學(xué), 1998, 6：32-34

[8]Porra R J, Thompson W A, Kriedemann P E. Determination of accurateextinction coefficients and simultaneous-equations for assaying chlorophyll-a and chlorophyll-b extracted with 4 different solvents - verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic- absorption spectroscopy[J]. Biochimica et Biophysica Acta(BBA) - Bioenergetics, 1989, 975(3)：384-394.

[9]段發(fā)平, 梁承鄴, 黎垣慶.Bar基因和轉(zhuǎn)Bar基因作物的研究進(jìn)展[J]. 廣西植物, 2001, (2)：166-172.

[10]Thompson C J, Movva N R, Tizard R, et al. Characterization of the herbicide-resistance genebarfromStreptomyces hygroscopicus[J]. EMBO J, 1987, 6(9)：2519-2523.

Transformation of phosphiothrici resistance gene(bar) inUndaria pinnatifidagametophytes

REN Bao-yong1,2, JIANG Peng1, CUI Yu-lin1,2, JIANG Jin-ju2,3, QIN Song1
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003,China)

Apr., 24, 2011

Undaria pinnatifidagametophyte; genetic engineering; phosphiothrici resistance gene

Undaria pinnatifidagametophytes were cultured in a 2.5 L airlift photobioreactor, and were transformed with phosphiothrici resistance gene (bar) by particle bombardment. After phosphiothrici screening, resistance colonies appeared. PCR and PCR Southern blotting results showed thatbargene had integrated into the genome of 60% of theU. pinnatifidagametophytes and could be a suitable selective marker forU. pinnatifidagametophyte genetic engineering.

S968.42 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-3096(2012)01-0006-04

2011-04-24;

2011-06-23

江蘇省科技計(jì)劃項(xiàng)目(BE2008341); 國家 863計(jì)劃項(xiàng)目(2009AA10Z106); 山東省博士基金項(xiàng)目(2010BSB02009); 山東東方海洋科技股份有限公司科研開放基金項(xiàng)目(200810)

任寶永(1985-), 男, 碩士研究生, 海洋藥物專業(yè), E-mail：baoyong2008@yahoo.cn; 秦松, 通信作者, 研究員, 博士, 從事海洋生物技術(shù)研究, E-mail：sqin@ms.qdio.ac.cn

梁德海)