郭書舉, 史大永, 李富超, 朱校斌, 繆宇平

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島266071; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)院 東海水產(chǎn)研究所, 上海 200090)

深海芽孢桿菌E401B03次生代謝產(chǎn)物分離和結(jié)構(gòu)鑒定

郭書舉1, 史大永1, 李富超1, 朱校斌1, 繆宇平2

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島266071; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)院 東海水產(chǎn)研究所, 上海 200090)

利用硅膠柱、凝膠柱及高效液相(HPLC)等色譜方法, 對采自中國南海的深海芽孢桿菌 E401B03發(fā)酵液的乙酸乙酯相浸膏進(jìn)行了分離, 通過1H-NMR、13C-NMR、EIMS等方法鑒定了7個化合物: N-苯乙基乙酰胺、3-(羥基乙?；?-吲哚、3-(2-羥基乙基)-吲哚、環(huán)(纈-纈)二肽、尿嘧啶、胸腺嘧啶、對羥基苯甲醛。

深海; 芽孢桿菌; 次生代謝產(chǎn)物

芽孢桿菌是一類重要的微生物, 廣泛存在于土壤、水、空氣中, 可以產(chǎn)生多種多樣的代謝物質(zhì), 如環(huán)肽、多肽、香豆素及大環(huán)內(nèi)酯類化合物[1-3]。深海芽孢桿菌因其獨(dú)特的生存環(huán)境, 可能產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的化合物。本研究以采自中國南海的芽孢桿菌 E401B03為研究對象, 對其發(fā)酵液的乙酸乙酯相提取物進(jìn)行了分離, 先期分離了 7個化合物, 并通過1H-NMR、13C-NMR等方法鑒定了其結(jié)構(gòu)分別為: N-苯乙基乙酰胺、3-(羥基乙?；?-吲哚、3-(2-羥基乙基)-吲哚、環(huán)(纈-纈)二肽、尿嘧啶、胸腺嘧啶、對羥基苯甲醛。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

BRUKER AVANCE-500型核磁共振儀; 三氯甲烷、二氯甲烷、四氯化碳、石油醚、乙酸乙酯、冰乙酸、三氟乙酸酐、溴素、香草醛、N-溴代丁二酰亞胺、乙醇鈉、乙醇均為分析純; 柱色譜硅膠(160～200 目)和薄層色譜硅膠 GF254(60型)為青島海洋化工廠產(chǎn)品。

芽孢桿菌E401B03從中國南海北部1400 m深海沉積物中分離。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

將菌種從固體斜面培養(yǎng)基取適量接種到固體培養(yǎng)基(蛋白胨5 g/L, 酵母粉1 g/L, 檸檬酸鐵0.01 g/L,瓊脂粉15 g/L, pH 7.6)的平板上, 28℃培養(yǎng)48 h后,作為種子接種到液體培養(yǎng)基(蛋白胨 5 g/L, 酵母粉1 g/L, 檸檬酸鐵0.01 g/L, pH 7.6)中, 共接種25 L,28℃, 130 r/min于搖床培養(yǎng)7 d。

1.2.2 提取分離

25 L發(fā)酵液用同體積的乙酸乙酯萃取 3次后,減壓蒸干得到1.50 g浸膏。浸膏經(jīng)硅膠柱色譜分離(石油醚: 乙酸乙酯, 氯仿: 甲醇梯度洗脫), 得到 13個組分, 組分 J2經(jīng)過凝膠柱和硅膠柱分離, 得到化合物6。組分J1經(jīng)過凝膠柱氯仿: 甲醇1:1洗脫, 得化合物7。組分E經(jīng)過凝膠柱分離, 得到化合物4。組分F經(jīng)過凝膠柱、HPLC分離, 得到化合物2和3。組分K經(jīng)凝膠柱、HPLC分離得到化合物5。組分G經(jīng)過凝膠柱、HPLC分離的化合物1。

2 波譜數(shù)據(jù)與結(jié)果鑒定

化合物1, 白色粉末, 易溶于甲醇。EI-MS: m/z[M]+163(22), 104(100), 91(20), 72(18);1H-NMR(CD3OD): 7.24(m, 2H), 7.16(m, 3H), 3.37(m, 2H),2.77(m, 2H), 1.89(s, 3H);13C-NMR(CD3OD): 172.9,140.1, 129.5, 129.2, 127.1, 41.8, 36.3, 22.6。以上數(shù)據(jù)與N-苯乙基乙酰胺的相關(guān)數(shù)據(jù)一致[4]。

化合物2, 淡黃色晶體, 易溶于甲醇。EI-MS: m/z[M]+175(20), 144(100), 116(21), 89(13);1H-NMR(CD3OD): 8.22(m, 1H), 8.19(s, 1H), 7.45(m, 1H), 7.22(m,2H), 4.73(s, 2H);13C-NMR(CD3OD): 196.0, 138.2, 134.0,126.9, 124.3, 123.2, 122.6, 114.9, 112.8, 66.2。以上數(shù)據(jù)與3-(羥基乙?；?-吲哚的相關(guān)數(shù)據(jù) 一致[5]。

化合物3, 淡黃色晶體, 易溶于甲醇。EI-MS:m/z [M]+161(25), 130(100), 103(8), 77(8);1H-NMR(CD3OD): 7.52(d, J=7.7Hz, 1H), 7.31(d, J=7.7Hz, 1H),7.06(m, 2H), 6.98(m, 1H), 3.80(t, J=7.15Hz, 2H),2.96(t, J=7.15, 2H);13C-NMR(CD3OD): 136.3, 128.0,123.3, 122.3, 119.4, 119.1, 112.2, 110.0, 63.6, 29.7。以上數(shù)據(jù)與3-(2-羥基乙基)-吲哚的相關(guān)數(shù)據(jù)一致[6]。

化合物4, 白色粉末, 易溶于氯仿。1H-NMR(CDCl3): 9.87(bs, 1H), 7.80(dd, J=9.2, 4.4Hz, 2H),6.96(dd, J=9.2, 4.4Hz, 2H);13C-NMR(CDCl3): 190.8,161.4, 132.2, 132.2, 130.0, 115.8, 115.8。EI-MS: m/z[M]+122(91), 121(100), 93(41), 65(42), 39(30). 以上數(shù)據(jù)對羥基苯甲醛的相關(guān)數(shù)據(jù)一致, 確定該化合物為對羥基苯甲醛。

化合物5, 白色粉末。1H-NMR(CDCl3): 3.86(m,2H), 2.25(m, 2H), 0.84(d, J=7.2, 6H), 0.72(d, J=7.2,6H);13C-NMR(CDCl3): 168.0, 168.0, 59.5, 59.5, 31.1,31.1, 18.1, 18.1, 16.2, 16.2。以上數(shù)據(jù)與化合物環(huán)(纈-纈)二肽的相關(guān)譜圖數(shù)據(jù)一致[7]。

化合物6, 白色粉末。1H-NMR(d6-DMSO):7.38(1H, d, J=7.5Hz), 5.45(1H, d, J=7.5Hz);13C-NMR(d6-DMSO): 164.4, 151.5, 142.3, 100.3。EI-MS: m/z[M]+112(100), 69(65), 42(47), 28(34).以上數(shù)據(jù)與尿嘧啶的相關(guān)數(shù)據(jù)一致, 確定該化合物為尿嘧啶。

化合物7, 白色粉末。1H-NMR(d6-DMSO):7.23(1H, s), 1.72(3H,s)。13C-NMR(d6-DMSO): 164.9,151.5, 137.7, 107.7, 11.7. EI-MS: m/z [M]+126(100),55(82), 28(34).以上數(shù)據(jù)與胸腺嘧啶的相關(guān)數(shù)據(jù)一致,確定該化合物為胸腺嘧啶。

化合物1-7的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1-7的結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

目前, 針對海洋微生物的研究, 還主要集中在近海, 但是在黑暗寡營養(yǎng)的深海, 同樣存在著大量的深海微生物。本研究以采自中國南海的深海細(xì)菌為研究對象, 先期從深海芽孢桿菌E401B03的次生代謝產(chǎn)物中分離并鑒定了7個化合物, 為深海微生物次生代謝產(chǎn)物的研究帶來了新的契機(jī)。目前, 本課題組正在對深海細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行深入研究。隨著人們對深海微生物資源的重視及研究的深入, 相信會有越來越多的深海微生物活性物質(zhì)被 發(fā)現(xiàn)。

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Isolation and identification of secondary metabolites produced by a deep-seaBacillussp. E401B03

GUO Shu-ju1, SHI Da-yong1, LI Fu-chao1, ZHU Xiao-bin1, MIAO Yu-ping2
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao, 266071, China; 2. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai, 200090, China)

Nov.,20,2011

deep-sea;Bacillussp.; secondary metabolites

Seven compounds, were isolated from the ethyl acetate extract ofBacillussp. E401B03. Compounds 1-7 were obtained by normal phase silica gel, Sephadex LH-20 chromatography and reverse phase HPLC techniques.Their structures were identified by spectroscopic methods including1H-NMR,13C-NMR, and EIMS.

R931.77 文獻(xiàn)標(biāo)識碼: A 文章編號: 1000-3096(2012)06-0028-03

2011-11-20；

2011-12-26

農(nóng)業(yè)部海洋與河口漁業(yè)資源及生態(tài)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室開放課題(開-09-03); 江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2011395)

郭書舉(1981-), 男, 山東聊城人, 助理研究員, 研究方向?yàn)楹Ｑ筇烊划a(chǎn)物, E-mail: guoshuju@qdio.ac.cn; 史大永, 通信作者, 電話:0532-82898719, E-mail: shidayong@qdio.ac.cn

康亦兼)