程沁園, 張家驪, 夏文水

(1. 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江南大學(xué) 食品學(xué)院, 江蘇 無錫 214122; 2. 江南大學(xué) 醫(yī)藥學(xué)院, 江蘇無錫 214122)

殼聚糖的脫乙酰度、分子質(zhì)量和性狀對(duì)其體外促凝血活性的影響

程沁園1, 張家驪2, 夏文水1

(1. 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江南大學(xué) 食品學(xué)院, 江蘇 無錫 214122; 2. 江南大學(xué) 醫(yī)藥學(xué)院, 江蘇無錫 214122)

制備不同脫乙酰度、分子質(zhì)量的殼聚糖固體粉末和溶液, 并利用試管法比較了不同濃度、不同性質(zhì)及不同狀態(tài)的樣品的體外凝血時(shí)間。結(jié)果表明: 當(dāng)分子質(zhì)量相近時(shí), 殼聚糖溶液的體外凝血時(shí)間隨脫乙酰度的增加而減少, 脫乙酰度中等的固體粉末具有最強(qiáng)的促凝血能力; 當(dāng)脫乙酰度相近時(shí), 只有高分子質(zhì)量的殼聚糖溶液具有一定的促凝血活性, 但固體粉末狀態(tài)的三種殼聚糖均具有一定的縮短體外凝血時(shí)間的能力; 同等劑量的殼聚糖溶液和粉末, 除了高脫乙酰度、高分子質(zhì)量的殼聚糖外, 其余樣品的固體粉末對(duì)于縮短體外凝血時(shí)間更為有效。

殼聚糖; 粉末; 溶液; 促凝血活性

殼聚糖(chitosan, CS)是一種由若干N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-氨基葡萄糖和 2-氨基-2-脫氧-D-氨基葡萄糖以 β-l,4-糖苷鍵形式連接而成的多糖, 是由甲殼素(chitin)部分或完全脫乙酰基的產(chǎn)物, 是自然界中唯一的天然堿性多糖, 也是少數(shù)具有正電荷的天然產(chǎn)物之一[1], 無毒, 物理和化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定, 同時(shí)具有良好的生物相容性、生物降解性及降血脂、絮凝、抗菌等多種生物活性, 因而在醫(yī)藥、化工、環(huán)境、食品等諸多方面顯示出良好的應(yīng)用前景[1-2]。

自1977年Muzzarelli首度報(bào)道了甲殼素對(duì)人類創(chuàng)傷的作用[3]后, 甲殼素和殼聚糖及其衍生物與血液的相互作用就成為研究熱點(diǎn)之一。多年研究顯示:甲殼素、殼聚糖及部分衍生物都具有良好的止血活性, 其作用機(jī)理目前雖尚未明確, 但可以肯定的是其作用過程完全不同于一般傳統(tǒng)的止血?jiǎng)4]。已有研究表明殼聚糖可黏附聚集紅細(xì)胞和血小板, 通過血小板的活化激活凝血途徑, 加速纖維蛋白膠的合成,刺激血管收縮, 最終封合傷口[5]。同時(shí)殼聚糖還具有一定的抗菌、止痛、促進(jìn)傷口愈合及減少疤痕的作用[6], 是一種理想的傷口敷料。

然而, 目前的研究大多集中于止血性殼聚糖的劑型開發(fā)[7-8]和作用機(jī)制研究[5], 尚未有對(duì)其狀態(tài)(固體粉末或溶液)對(duì)止血活性的影響報(bào)道。本文主要對(duì)比研究了不同脫乙酰度、分子質(zhì)量的殼聚糖在不同狀態(tài)下(溶液或固體粉末)體外促凝血活性的差異。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

殼聚糖(CS): 實(shí)驗(yàn)室自制, 粉末粒徑<0.44 mm;兔血: 新西蘭白兔耳緣靜脈取血, 3.8%枸櫞酸鈉抗凝;乙酸酐(AcO2)、乙酸(HAc)、過氧化氫(H2O2)、鹽酸(HCl)等, AR, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 云南白藥粉: 4g/瓶, 批號(hào) 20080420, 云南白藥股份集團(tuán)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同脫乙酰度和不同分子質(zhì)量殼聚糖的制備

以高脫乙酰度的殼聚糖為原料, 參照文獻(xiàn)[9]中的乙酸酐-吡啶法, 在反應(yīng)體系中加入不同量的乙酸酐制備得不同脫乙酰度的殼聚糖, 沉淀洗凈后凍干樣品。

以高分子質(zhì)量的殼聚糖為原料, 參照文獻(xiàn)[10]用HAc/H2O2體系對(duì)其進(jìn)行不同時(shí)間的降解得到一系列分子質(zhì)量較低的殼聚糖樣品, 沉淀洗凈后凍干。

參照文獻(xiàn)[11-12], 采用酸堿滴定法和烏氏黏度法分別測(cè)定殼聚糖的脫乙酰度和黏均分子質(zhì)量。結(jié)果如表 1所示。本實(shí)驗(yàn)制得一系列分子質(zhì)量相近、脫乙酰度依次降低的殼聚糖樣品(CS、CS-A、CS-B)和脫乙酰度相近、分子質(zhì)量依次降低的殼聚糖樣品(CS、CS-a、CS-b)。

表1 殼聚糖樣品的脫乙酰度和黏均分子質(zhì)量Tab. 1 Degrees of deacetylation and molecular weights of chitosan samples

1.2.2 試管法測(cè)定凝血時(shí)間

[13]的方法, 取潔凈的試管, 分別加入1 mL濃度分別為40、2 g/L的殼聚糖–0.1 mol/L鹽酸溶液或80、40、20、10 mg的殼聚糖粉末, 1 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液或空白試管作陰性對(duì)照, 1 mL濃度為40 g/L、2 g/L云南白藥–0.1mol/L鹽酸混懸液或40 mg云南白藥粉末作陽(yáng)性對(duì)照, 每樣品每濃度設(shè) 3支試管。將各管輕輕搖勻或使粉末盡量鋪開于試管底部,37℃水浴中保溫 1 h, 自兔耳緣靜脈取血開始計(jì)時(shí),依次將1 mL兔血加入上述試管中, 平穩(wěn)地移入37℃水浴中, 每隔30 s將第一支試管傾斜一次(角度小于30°), 其余兩支暫時(shí)不要?jiǎng)? 直到第一支試管緩慢倒置血流不動(dòng)為止, 以同樣方法觀察第二、第三支試管,至第三管內(nèi)的血全凝后, 按停秒表, 記下該組的凝血時(shí)間。凝血時(shí)間以60 min為上限, 超過即判為不凝血。每樣品重復(fù)6次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“ˉx±s”表示, 多組間兩兩比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫乙酰度對(duì)殼聚糖溶液及粉末的促凝血活性的影響

2.1.1 不同脫乙酰度殼聚糖溶液的體外凝血時(shí)間

不同濃度、不同脫乙酰度的殼聚糖-鹽酸溶液的體外促凝血活性如圖1所示。

圖1 不同脫乙酰度殼聚糖-鹽酸溶液的體外凝血時(shí)間* 表示與空白對(duì)照組相比的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P<0.05, ** 表示 P<0.01;## 表示與云南白藥組相比的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異為P<0.01Fig. 1 The cogulation time of chitosan-HCl solutions with different degrees of deacetylation in vitro* denotes comparison with the control group, P<0.05, ** denotes P<0.01; ## denotes comparison with Yunnan Baiyao P<0.01

由圖 1可知, 各脫乙酰度、各濃度的殼聚糖-鹽酸溶液均有一定的體外促凝血能力, 且其活性隨脫乙酰度的降低而降低。與空白組相比, 高脫乙酰度(85.32%)的CS高、低濃度組和中等脫乙酰度(68.22%)的 CS-A高濃度組的凝血時(shí)間有極顯著的差異(P<0.01)。同時(shí), 殼聚糖的促凝血能力與其濃度高低具有相關(guān)性。此外, 高脫乙酰度的CS-鹽酸溶液的凝血時(shí)間更比同濃度的云南白藥-鹽酸混懸液極顯著縮短(P<0.01), 其體外促凝血能力更優(yōu)于云南白藥混懸液。

2.1.2 不同脫乙酰度殼聚糖粉末的體外凝血時(shí)間

不同劑量、不同脫乙酰度的殼聚糖粉末的體外促凝血活性如圖2所示。由圖2可知, 與空白試管中兔血的凝固時(shí)間相比, 終濃度為 40 g/L的 CS粉末(脫乙酰度為 85.32%)和 80、40、10 g/L的 CS-A粉末(脫乙酰度為 68.22%)均具有極顯著的體外促凝血能力(P<0.01), 終濃度為80、20 g/L的CS粉末、20 g/L的CS-A粉末及80 g/L的CS-B粉末具有顯著的促凝血活性(P<0.05)。此外, 終濃度為40 g/L的CS粉末、80、40、10 g/L CS-A粉末和80 g/L CS-B粉末的凝血時(shí)間均值(分別為517.90、258.86、171.55、466.36及416.45 s)都低于陽(yáng)性對(duì)照40 g/L云南白藥的凝血時(shí)間(540.36 s)。三種不同脫乙酰度的殼聚糖粉末相比, 脫乙酰度為 68.22%的 CS-A具有最好的促凝血能力, CS次之, CS-B最差, 且各樣品的促凝血活性呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。

圖2 不同脫乙酰度殼聚糖粉末的體外凝血時(shí)間* 表示與空白對(duì)照組相比的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P<0.05, ** 表示 P<0.01Fig. 2 The cogulation time of chitosan powder with different degrees of deacetylation in vitro* denotes comparison with the control group, P<0.05, ** denotes P<0.01

2.2 分子質(zhì)量對(duì)殼聚糖溶液及粉末的促凝血活性的影響

2.2.1 不同分子質(zhì)量殼聚糖溶液的體外凝血時(shí)間

不同濃度、不同分子質(zhì)量的殼聚糖-鹽酸溶液的體外促凝血活性如圖3所示。

圖3 不同分子質(zhì)量殼聚糖-鹽酸溶液的體外凝血時(shí)間** 表示與空白對(duì)照組相比的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P<0.01; ## 表示與云南白藥組相比的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異為P<0.01Fig. 3 The cogulation time of chitosan-HCl solutions with different molecular weight in vitro** denotes comparison with the control group, P<0.01; ## denotes comparison with Yunnan Baiyao P<0.01

由圖 3可知, 各分子質(zhì)量、高低各濃度的殼聚糖-鹽酸溶液的體外促凝血能力差異較大。高分子質(zhì)量(12.20×105, Da)的 CS溶液與空白對(duì)照相比, 其體外凝血時(shí)間極顯著縮短(P<0.01), 甚至比對(duì)應(yīng)同濃度的云南白藥混懸液的凝血時(shí)間都有極顯著縮短(P<0.01), 但中等分子質(zhì)量的 CS-a(1.45×105, Da)只在低濃度時(shí)略有促凝血活性, 低分子質(zhì)量的 CS-b(0.16×105, Da)則已完全無體外促凝血活性。因此, 分子質(zhì)量的高低對(duì)殼聚糖溶液的促凝血活性具有極其顯著的影響, 只有高分子質(zhì)量的殼聚糖溶液才具有較強(qiáng)的體外促凝血能力。

2.2.2 不同分子質(zhì)量殼聚糖粉末的體外凝血時(shí)間

不同劑量、不同分子質(zhì)量的殼聚糖粉末的體外促凝血活性如圖4所示。

圖4 不同分子質(zhì)量殼聚糖粉末的體外凝血時(shí)間* 表示與空白對(duì)照組相比的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P<0.05, ** 表示 P<0.01Fig. 4 The cogulation time of chitosan powder with different molecular weight in vitro* denotes comparison with the control group, P<0.05, ** denotes P<0.01

由圖 4可知, 各分子質(zhì)量的殼聚糖粉末都有一定的體外促凝血能力, 終濃度為40 g/L的CS粉末、80、40、20 g/L CS-a粉末及40 g/L CS-b粉末的體外凝血時(shí)間都較空白對(duì)照有極顯著的縮短(P<0.01), 且與云南白藥組對(duì)照無顯著差異; 終濃度為80、20 g/L的CS粉末和80 g/L CS-b粉末的體外凝血時(shí)間則都較空白對(duì)照顯著縮短(P<0.05)。

此外, 對(duì)比圖1和圖2、圖3和圖4可以發(fā)現(xiàn), 同等劑量的殼聚糖溶液和粉末(終濃度均為20 g/L), 除了高脫乙酰度、高分子質(zhì)量的CS外, 其余樣品的固體粉末均能更為有效地縮短體外凝血時(shí)間, 尤其是分子質(zhì)量較低的 CS-a和CS-b在溶液狀態(tài)時(shí)基本無促凝血活性, 而其粉末卻仍可保持一定的促凝血能力, 其中CS-a的促凝血活性更可與高出一倍劑量的云南白藥相媲美(P=0.702)。

3 結(jié)論

本文主要對(duì)比研究了殼聚糖的脫乙酰度、分子質(zhì)量及狀態(tài)(溶液或固體粉末)對(duì)其體外促凝血活性的影響。結(jié)果顯示: 三個(gè)因素對(duì)殼聚糖的促凝血活性的影響互有交叉。

當(dāng)分子質(zhì)量相近時(shí)(CS、CS-A、CS-B), 溶液狀態(tài)的殼聚糖的體外凝血時(shí)間隨脫乙酰度的增加而縮短, 即促凝血活性增加; 而固體粉末狀態(tài)的殼聚糖體外凝血時(shí)間變化規(guī)律略有不同, 脫乙酰度中等(68.22%)的CS-A具有最強(qiáng)的促凝血能力。

而當(dāng)脫乙酰度相近時(shí)(CS、CS-a、CS-b), 只有高分子質(zhì)量的CS溶液具有一定的促凝血活性, 但固體粉末狀態(tài)的三種殼聚糖均具有一定的縮短體外凝血時(shí)間的能力, 且活性大致相當(dāng), 分子質(zhì)量的影響并不十分明顯。

同時(shí)對(duì)比發(fā)現(xiàn), 除了高脫乙酰度、高分子質(zhì)量的CS外, 其余同等劑量的殼聚糖樣品的固體粉末對(duì)于縮短體外凝血時(shí)間更為有效, 而分子質(zhì)量的影響更為顯著。

因此, 鑒于高脫乙酰度、高分子質(zhì)量殼聚糖制備成本較高, 且適合溶劑較少, 生產(chǎn)開發(fā)的困難較大,因此建議可將研究重點(diǎn)置于分子質(zhì)量較低、脫乙酰度中等的殼聚糖, 開發(fā)其粉末制劑應(yīng)用于人類或動(dòng)物的止血中。

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The effects of degrees of deacetylation, molecular weights and states of chitosans on procoagulant activities in vitro

CHENG Qin-yuan1, ZHANG Jia-li2, XIA Wen-shui1
(1. Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, 1800 Lihu Avenue, Wuxi 214122;2. School of Medicine and Pharmaceutics, Jiangnan University, 1800 Lihu Avenue, Wuxi 214122)

May,19,2011

chitosan; powder; solution; procoagulant activity

To investigate the effects of degrees of deacetylation, molecular weights and states (solutions or solid powder) of chitosans on the procoagulant activities in vitro, the blood clotting time of the samples with different concentrations, properties and states were tested the in tube method. When molecular weights were close, the blood clotting time of chitosan solutions decreased with the increasing of degree of deacetylation, however, the procoaglant ability of the chitosan powder with medium degree of deacetylation was the best of all. When degrees of deacetylation were close, the solution of chitosan with high molecular weight was the only one that had procoagulant activity, but all the powders could decrease the clotting time in vitro. All solid chitosan powders, except the one with high degree of deacetylation and molecular weight, promoted the blood coaglations more efficiently than the correspondent solution at the same concentration.

R962; O636.1

A

1000-3096(2012)06-0059-05

2011-05-19;

2011-12-04

國(guó)家 863計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA091603); 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 2008年目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目(SKLF-MB-200805); PCSIRT0627;111 project-B07029

程沁園(1981-), 女, 江蘇無錫人, 博士研究生, 研究方向:生物活性物質(zhì)研究, E-mail: cheng-qinyuan@163.com; 夏文水, 通信作者, E-mail: xiaws@jiangnan.edu.cn

(本文編輯：康亦兼)