江靈芝, 孫 雪, 楊 銳, 駱其君

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院, 浙江 寧波315211)

利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析浙江沿海4株壇紫菜的遺傳多樣性

江靈芝, 孫 雪, 楊 銳, 駱其君

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院, 浙江 寧波315211)

利用 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對采自浙江省南麂島和漁山列島的4株不同形狀野生壇紫菜(Porphyra haitanensis)進(jìn)行了遺傳多樣性分析。從33條引物中篩選出11條可擴(kuò)增出清晰條帶的引物, 在4株壇紫菜中共擴(kuò)增出62條DNA帶, 其中多態(tài)性條帶比例達(dá) 88.71%。遺傳距離分析表明4株壇紫菜之間的遺傳距離范圍是 0.3226~0.6129, 聚類分析結(jié)果表明漁山列島壇紫菜遺傳距離最近, 而南麂島的兩株壇紫菜則距離相對較遠(yuǎn)。該研究說明浙江附近島嶼的野生壇紫菜遺傳多樣性豐富。

壇紫菜(Porphyra haitanensis); ISSR; 遺傳多樣性

紫菜(Porphyra)是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價值的海藻,多分布于亞熱帶與溫帶的潮間帶。紫菜營養(yǎng)豐富, 口味鮮美, 是廣受中、日、韓等國家人們喜愛的食品。現(xiàn)今, 全世界已發(fā)現(xiàn)的紫菜約有134種, 僅中國就有22種, 南韭山、漁山、檀頭山、南麂島等島嶼都有野生紫菜分布[1]。紫菜的生活史可以分成大型葉狀體和絲狀孢子體兩種不等世代型。紫菜的分類一般是根據(jù)顏色和厚度等葉片形態(tài)、細(xì)胞特性、生殖細(xì)胞的分裂特點(diǎn)及其生活史特征等進(jìn)行歸類。但是, 形態(tài)特征具有局限性, 某些特征有可能是環(huán)境與基因型互作的結(jié)果, 這使得要把紫菜進(jìn)行準(zhǔn)確分類及研究產(chǎn)生一定的困難[2-3]。

近些年來多種分子標(biāo)記技術(shù), 如擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA (RAPD)、微衛(wèi)星(SSR)、簡單重復(fù)序列間隔序列(ISSR)等被廣泛用于紫菜種質(zhì)鑒定、品系區(qū)分、遺傳多樣性分析等研究中。其中ISSR分子標(biāo)記由于具有重復(fù)性強(qiáng)、操作簡便、成本低等優(yōu)點(diǎn), 目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于高等植物和海藻等研究領(lǐng)域[4-8]。如陳昌生等[9]利用ISSR分子標(biāo)記對福建省的3個野生壇紫菜種群共60個個體進(jìn)行了遺傳多樣性分析, 結(jié)果表明壇紫菜種群內(nèi)個體間的遺傳變異較大, 遺傳多樣性水平較高。謝潮添等[10]用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對4個不同顏色壇紫菜(P.haitanensis)絲狀體品系及 1個野生型對照品系進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)這 4個不同絲狀體間的平均遺傳距離為0.5727, 它們同野生型對照的平均遺傳距離為0.6564。以上研究證明ISSR技術(shù)在紫菜的遺傳多樣性研究中應(yīng)用廣泛, 并且紫菜的遺傳多樣性十分豐富。

本文以采自浙江省地理環(huán)境差異顯著的兩個島南麂島和漁山列島的形態(tài)不同的 4株壇紫菜作為實(shí)驗(yàn)材料, 利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)來探討其間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近和遺傳多樣性, 為今后野生壇紫菜遺傳圖譜的構(gòu)建、優(yōu)良品系的選育以及浙江省壇紫菜種質(zhì)資源的保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用的4株壇紫菜, 其中2株采自浙江省溫州市平陽縣南麂島, 另 2株采自浙江省寧波市象山縣漁山列島。這4株壇紫菜的外觀特征不同, 其名稱代碼、產(chǎn)地及形態(tài)特征如表 1所示。將上述紫菜采回后自然晾干處理后, 放置于冰箱中保存。

表1 所用壇紫菜的代碼、產(chǎn)地和特征Tab. 1 The codes, origins and characteristics of Porphyra haitanensis

1.2 DNA的提取

實(shí)驗(yàn)前將存于－20℃冰箱的壇紫菜取出, 在滅菌海水中復(fù)蘇過夜。用毛刷反復(fù)輕刷葉片表面后置于0.7%碘化鉀溶液中浸泡5~10 min, 最后再置于滅菌海水中沖洗數(shù)次。各取 5~6片健康紫菜的葉片幼嫩部分進(jìn)行基因組DNA提取。

采用 CTAB法結(jié)合基因組 DNA提取試劑盒的GenClean小柱子(上海捷瑞生物工程有限公司)進(jìn)行紫菜基因組DNA的提取。

1.3 ISSR 引物的選擇

本次實(shí)驗(yàn)共用了33條ISSR引物, 從這33條引物中篩選出能夠出現(xiàn)清晰可見的可重復(fù)的擴(kuò)增片段的 02、04、05、07、26、61、63、G2、G3、G5、G6 11條引物。這些ISSR引物的名稱、序列與退火溫度見表2。

表2 引物序列、退火溫度及其多態(tài)性比例Tab. 2 Sequences, annealing temperatures and the polymorphic ratios of ISSR primers

1.4 PCR 反應(yīng)及電泳

PCR 反應(yīng)(Biometra PCR 儀)體系如下: 1.5 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTP, 0.2 μmol/L 引物,15 ng DNA 模板和 1 個單位 DNA 聚合酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 首先 94 ℃下預(yù)變性 5 min; 接著, 設(shè)置 35個循環(huán), 94 ℃下變性 45 s, 退火 1 min(退火溫度見表 2), 然后再 72 ℃下延伸 2 min; 最后,72 ℃下延伸 10 min; 取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳, 電泳結(jié)束后, 拍照記錄電泳結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理

電泳圖譜的每一條帶為一個標(biāo)記, 代表一個引物的結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)各個分子標(biāo)記的遷移率及其有無來統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù), 若有條帶出現(xiàn)記做 1, 若無條帶出現(xiàn)記做0。運(yùn)用Nei和Li等的公式S=2Nij/(Ni+Nj)計(jì)算樣品間的相似性系數(shù), 其中Ni為樣品i有的條帶數(shù),Nj為樣品j有的條帶數(shù);Nij為樣品i和樣品j都有的條帶數(shù)[11]。遺傳距離D=1－S, 用Popgen32軟件進(jìn)行分析與作圖。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增結(jié)果圖譜

4株壇紫菜的 11 條引物擴(kuò)增結(jié)果見圖 1(圖中的 1, 2, 3, 4 分別代表表1所列的4株壇紫菜)。擴(kuò)增結(jié)果表明, 本研究所用的 11 條引物在不同壇紫菜中擴(kuò)增出數(shù)目與位置均不同的可重復(fù)性的條帶,擴(kuò)增片段大小都在 100bp 至 2000bp 的范圍內(nèi)。通過統(tǒng)計(jì) 11 條引物在 4種樣品中共擴(kuò)增出 62 條DNA 帶, 其中多態(tài)性 DNA 條帶 55 條, 占88.71%。

2.2 四株壇紫菜的遺傳距離和聚類分析

根據(jù)圖1, 記錄條帶情況, 再依據(jù)Nei等的計(jì)算方法, 求出 4株不同壇紫菜間的遺傳距離(表3)。如表3所示, 表中數(shù)據(jù)表示4株壇紫菜的遺傳距離。根據(jù)表 3可知, 4株壇紫菜之間的遺傳距離范圍是0.3226~0.6129。其中, YS-1和YS-2的遺傳距離最小,只有0.3226; NJ-1和NJ-2的遺傳距離最大是0.6129。根據(jù)表 3中所示的 4株壇紫菜的遺傳距離, 用Popgen32軟件進(jìn)行分析, 得到聚類分析圖(圖2)。如圖2所示, YS-1和YS-2的相似性最高, 所以首先相聚在一起, 再與NJ-2相聚類, 最后再與NJ-1相聚。

圖1 11條引物在4株壇紫菜中的ISSR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 The ISSR products of 11 primers amplified from the four strains of Porphyra haitanensisM. 為 DL2000 DNA Marker, 1-4.分別代表表1所列的4株壇紫菜M. DL2000 DNA Marker; 1-4. represented 4 strains of P. haitanensis shown in Tab. 1

表3 4株壇紫菜的遺傳距離Tab. 3 Genetic distances of four strains of Porphyra haitanensis

圖2 4株紫菜的聚類圖Fig. 2 The cluster diagram of four strains of Porphyra haitanensis

3 討論

分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中基因組DNA的質(zhì)量是成功與否關(guān)鍵的一步[12]。相對來說, 提取紫菜絲狀體的基因組DNA較為容易。但是紫菜的葉狀體細(xì)胞壁較絲狀體不易破碎, 而且含有很多粘性多糖, 所以紫菜葉狀體DNA提取的量都很低, 而且純度不高[13]。本次實(shí)驗(yàn)提取基因組 DNA時所采用的是常用的提取植物DNA的 CTAB試劑, 再結(jié)合離心柱法, 可以從少量的樣品中提取出實(shí)驗(yàn)所需的 DNA模板。結(jié)果表明CTAB結(jié)合試劑盒法提取所得的紫菜DNA的純度和量可滿足ISSR擴(kuò)增要求。

很多研究都表明紫菜具有較高的遺傳多態(tài)性。如 Dutcher等[14]用 RAPD分子標(biāo)記對采自北大西洋西部海域以及墨西哥海灣的 3種不同品系紫菜進(jìn)行研究時, 發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性范圍為 35%~100%。賈建航等[15]用RAPD分子標(biāo)記分析15株紫菜絲狀體, 其多態(tài)性高達(dá)97.1%; 楊銳等[16]用AFLP分子標(biāo)記對采自浙江漁山列島、南麂列島以及福建等地的壇紫菜進(jìn)行分析, 結(jié)果表明其多態(tài)位點(diǎn)比例高達(dá) 96.97%, 并且其結(jié)果表明紫菜的遺傳相似程度與地域分布相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中分布于漁山列島的2株壇紫菜YS-1和YS-2雖然葉狀體的形狀有差別, 但其遺傳相似性較高, 原因可能是受相同的生長環(huán)境以及地理位置的影響。采自南麂島的 NJ-2和采自漁山列島的 YS-1地理位置和生長環(huán)境明顯不同, 它們相似系數(shù)高的原因則有可能是DNA的關(guān)系。由以上可知, 在本研究中, 以地理環(huán)境為主影響壇紫菜品系和以基因組DNA為主影響壇紫菜品系的兩種情況均出現(xiàn)了, 說明不同體系壇紫菜的種內(nèi)遺傳距離并不是單一地受地理環(huán)境或DNA的影響。同時本次試驗(yàn)中的4株壇紫菜的多態(tài)位點(diǎn)百分率為 88.71%, 和一般植物相比明顯較高[17], 這顯示壇紫菜的種間遺傳差異很大。另外, 由于壇紫菜多為雌雄異體, 只有極少部分為雌性同體, 而且壇紫菜不進(jìn)行無性生殖[18], 長此以往,壇紫菜漸漸分化開來, 變異越來越大, 因此壇紫菜就具有比較高水平的遺傳多樣性。

海洋中的資源非常豐富, 其中生物種質(zhì)資源對于國家來說是極為重要的戰(zhàn)略性資源, 更是世界各國的關(guān)注點(diǎn), 它的重要性不言而喻。作為貝藻王國的南麂列島, 成為首批五個國家級海洋類自然保護(hù)區(qū)之一, 又成為我國唯一納入聯(lián)合國教科文組織世界生物圈保護(hù)網(wǎng)絡(luò)的海洋類生物保護(hù)區(qū)。去年, 漁山列島成為我國海洋特別保護(hù)區(qū), 藻類資源是二島的重要特色。壇紫菜是我國的特色紫菜之一, 浙江省在紫菜的生物多樣性方面, 具有獨(dú)特的優(yōu)勢。但是由于海洋污染的日益嚴(yán)重和人們的過度開發(fā)破壞紫菜的生長地, 野生壇紫菜面臨著資源越來越匱乏的境地。因此, 人們應(yīng)該重視紫菜資源的保護(hù), 加強(qiáng)對野生紫菜種質(zhì)資源的研究和合理開發(fā)利用。

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Genetic diversity analysis of four Zhejiang coastal Porphyra haitanensis strains with ISSR marker

JIANG Ling-zhi, SUN Xue, YANG Rui, LUO Qi-jun
(School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Jul., 25,2011

Porphyra haitanensis; ISSR; genetic diversity

The genetic diversity of four morphologically different Porphyra haitanensis strains collected from Nanji Island and Yushan Island of Zhejiang Province was analyzed with ISSR markers. In total, 11 primers were selected out from 33 primers for diversity analysis. These primers amplified 62 bands, and 88.71% of the bands were polymorphic. The genetic distance of the four strains of P. haitanensis ranged from 0.3226 to 0.6129. Two strains from Nanji Island were clustered together first, with other two strains Yushan Island joined then, indicating that the wild P. haitanensis along Zhejiang Provincial coast is rich in diversity.

S917.3

A

1000-3096(2012)06-0089-05

2011-07-25; 2011-10-22

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD13B08); 國家公益性行業(yè)(海洋)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201105009); 國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201003068)

江靈芝(1987-), 女, 碩士研究生, 主要從事分子生物學(xué)與遺傳育種研究, 電話: 0574-87600170, E-mail: zihan19870101@163.com;孫雪, 通信作者, 碩士生導(dǎo)師, 電話: 0574-87600170, E-mall:sunxue@nbu.edu.cn

(本文編輯：梁德海)