王琛 郭芳芳 張昀 鞏倫禮 崔磊

應(yīng)用脂肪干細胞構(gòu)建組織工程化小口徑血管平滑肌層的實驗研究

王琛 郭芳芳 張昀 鞏倫禮 崔磊

目的 探索利用脂肪干細胞在生物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建組織工程血管平滑肌層的可行性。方法 用抽吸的脂肪獲取脂肪干細胞，在生長因子TGF-β1和BMP4作用下誘導(dǎo)成平滑肌細胞，然后將誘導(dǎo)的平滑肌細胞接種于PGA上，將細胞-材料復(fù)合物置于生物反應(yīng)器內(nèi)進行培養(yǎng)，在模擬胚胎發(fā)育血流動力學(xué)的刺激下（搏動頻率：75次/分；擴展量<5%），構(gòu)建小口徑的血管平滑肌組織。培養(yǎng)8周后，取材行組織學(xué)和生物力學(xué)檢測并與正常血管對比。結(jié)果 脂肪干細胞在TGF-β1和BMP4的誘導(dǎo)下，細胞呈現(xiàn)平滑肌細胞特有的“波峰-波谷”樣生長特點，并表達平滑肌細胞的特異性標(biāo)記物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC；反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周后，構(gòu)建的管狀組織膠原分泌旺盛，具有一定的力學(xué)強度和彈性。結(jié)論 利用脂肪干細胞可在體外生物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建組織工程化小口徑血管平滑肌層，為臨床上小血管病變的修復(fù)提供了一種新的可能的途徑。

聚羥基乙酸 脂肪干細胞 平滑肌細胞 血管組織工程 生物反應(yīng)器

血管組織的缺損是臨床上常見的外科疾病之一。目前臨床上大多采用自體移植、異體移植以及人工合成替代品移植技術(shù)來修復(fù)這些缺損，但這些方法各有其缺點，很難滿足臨床上血管缺損修復(fù)的需要[1-2]。組織工程學(xué)的產(chǎn)生為血管病變的修復(fù)提供了新的途徑。脂肪干細胞（Adipose derived stem cell，ADSCs）來源廣泛，取材方便，對供體損傷小，體外增殖能力強，不受年齡影響[3-4]，有望作為構(gòu)建組織工程血管的種子細胞。同時，我們的前期實驗也證明，在應(yīng)用能模擬體內(nèi)血流循環(huán)、血管搏動的裝置（血管生物反應(yīng)器）的作用下，可以產(chǎn)生具有一定力學(xué)強度的組織工程化血管平滑肌層[5-6]。本實驗在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用hADSCs作為種子細胞，在轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4（BMP4）的作用下，向平滑肌細胞誘導(dǎo)分化，并應(yīng)用生物反應(yīng)器在體外構(gòu)建組織工程化血管組織。

1 材料和方法

1.1 hADSC的分離、培養(yǎng)

脂肪組織來源于我科脂肪抽吸術(shù)患者，均為女性，平均年齡30歲。根據(jù)Zuk等[7]的方法進行，即：無菌PBS沖洗脂肪，用0.075%Ⅰ型膠原酶（Sigma-Aldrich公司）在37℃搖床中消化60 min后，加同體積含10%FBS（Gibco公司）的低糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 200 g離心10 min，小心吸除上層脂肪油層和大部分上清，50 μm濾網(wǎng)過濾離心成分，再以600 g離心10 min，去除上清，用含10%FBS的LGDMEM培養(yǎng)液重懸細胞，以4.0×104cells/cm2接種于10 cm培養(yǎng)皿，24 h后去除非貼壁細胞，之后每隔3天換液，細胞達80%～90%融合時，常規(guī)傳代，第4～6代的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2 hADSC向平滑肌細胞的誘導(dǎo)分化

當(dāng)hADSCs達50%～60%融合時，分組加入不同的培養(yǎng)液進行誘導(dǎo)觀察：①LG-DMEM+10%FBS（正常培養(yǎng)液）；②LG-DMEM+1%FBS；③LG-DMEM+1%FBS+5 ng/mL TGF-β1； ④LG-DMEM+1%FBS+2.5 ng/mL BMP4；⑤LG-DMEM+1%FBS+2.5 ng/mL BMP4+5 ng/mL TGF-β1。人臍動脈平滑肌細胞（hUASMCs）作為陽性對照。每2天換液一次，共誘導(dǎo)7 d。

1.3 細胞生長曲線的檢測

將不同培養(yǎng)液中的細胞分 1 d、3 d、5 d、7 d和10 d五個時間點以DNA定量的方法進行計數(shù)。即以0.5 mg/mL的蛋白酶K溶解消化細胞，每孔0.5 mL，56℃過夜。1 200 r/min離心，洗去40 μL上清與160 μL Hoechst33258染液混合，移入黑色平底96孔板中，避光37℃孵化20 min，以全波段酶標(biāo)儀檢測360 nm熒光強度（激發(fā)光波長465 nm）。并以相同方法檢測確定細胞數(shù)的DNA的360 nm熒光強度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測熒光值得出所測樣本的細胞數(shù)。

1.4 免疫熒光檢測

乙醇∶冰醋酸（99∶1）固定細胞或組織切片 15 min，PBS漂洗；10%羊血清封閉30 min；加適當(dāng)稀釋的一抗：鼠單克隆抗 α-SMA（Sigma-Aldrich 公司）、SMMHC（Sigma-Aldrich公司），兔多克隆抗 SM22α（Abcam公司）和兔單克隆抗calponin（Abcam公司），4℃過夜；PBS漂洗，滴加FITC標(biāo)記的相應(yīng)二抗，37 ℃孵育 45 min，PBS 漂洗；碘化丙啶（PI）襯核后，熒光顯微鏡下觀察。以臍動脈平滑肌細胞為陽性對照。

1.5 RT-PCR檢測

用Trizol提取不同條件下誘導(dǎo)7 d的細胞內(nèi)總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后進行PCR擴增檢測平滑肌特異性標(biāo)記物α-SMA、SM22α、calponin和SMMHC的表達，反應(yīng)條件：95℃3 min變性，95℃30 sec，56℃30 sec，72℃60 sec，35個循環(huán)，72℃延伸 10 min。引物序列如表1。

表1 RT-PCR反應(yīng)引物序列Table 1 Primers for RT-PCR

1.6 Western-Blotting檢測

用細胞裂解緩沖液裂解細胞或組織，獲取蛋白，將蛋白與2×上樣緩沖液混合后，SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將印跡后的PVDF膜用甲醇浸泡，加入封閉液（5%BSA，TBST），4℃封閉過夜。各一抗和β-actin加入膜上，4℃過夜，吸去一抗，加入IRDye 700DX或IRDye 800CW標(biāo)記的二抗，以O(shè)dyssey紅外圖像成像系統(tǒng)掃描成像，β-actin的表達作為各組細胞的內(nèi)參。

1.7 PGA膜片制備及細胞-PGA復(fù)合物體外培養(yǎng)

將50 mg未編織的PGA纖維制作成55 mm×45 mm×2 mm大小的膜片，75%乙醇浸泡1 h，紫外線照射30 min，用標(biāo)準(zhǔn)DMEM液浸泡過夜。收集hADSCs 5×107cells/mL，將1 mL的細胞懸液接種于PGA材料上，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，黏附4 h后加入誘導(dǎo)液，體外培養(yǎng)皿中培養(yǎng)7 d，取細胞-PGA復(fù)合物同時做掃描電鏡觀察和DiO標(biāo)記細胞后的激光共聚焦顯微鏡，觀察細胞在材料上的黏附情況。

1.8 細胞-PGA復(fù)合物在生物反應(yīng)器內(nèi)的動態(tài)培養(yǎng)

1周后，將細胞-PGA復(fù)合物卷裹于反應(yīng)器反應(yīng)槽內(nèi)的無菌硅膠管上（內(nèi)徑4 mm），并用無菌可吸收縫線固定。動態(tài)組：將其接于動態(tài)槽內(nèi)接口，予以動態(tài)力學(xué)刺激（參數(shù)設(shè)定為搏動頻率75次/分，擴張量<5%，流量為70～80 mL/min至100～120 mL/min，壓力為0.01～0.02 MPa）。每周換液1次，共培養(yǎng)8周。

1.9 組織學(xué)檢測

常規(guī)石蠟切片，分別做HE染色、Masson三色染色和Gomori醛復(fù)紅染色觀察新生管樣組織的組織學(xué)特點、膠原分泌情況和彈性纖維的合成情況。

1.10 生物力學(xué)檢測

用INSTRON力學(xué)測定儀對構(gòu)建的組織的最大張力、彈性模量和縫線張力進行測定。

1.11 組織工程化血管膠原含量的測定

將構(gòu)建的組織稱重，并用10∶1比例的胃蛋白酶進行消化，振蕩過夜，根據(jù)Sircol Soluble Collagen Assay試劑盒，用分光光度儀測量540 nm處的光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定測定組織中總膠原的含量，用μg/g濕重表示。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

所有結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件（Student's t檢驗）進行統(tǒng)計學(xué)分析，當(dāng)P<0.05時，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)觀察

hADSCs在正常培養(yǎng)液培養(yǎng)下細胞呈成纖維樣梭形生長（圖1a），在單純低血清培養(yǎng)液（BM）中呈扁平樣生長（圖1b），而在含有TGF-β1和/或BMP4的誘導(dǎo)液的作用下，細胞呈梭形生長，與hUASMCs的生長形態(tài)相似，呈平滑肌細胞特有的“波峰-波谷”樣生長模式（圖1c～f）。 TGF-β1和 BMP4的聯(lián)合誘導(dǎo)作用下細胞形態(tài)變化更明顯，Phalloidin染色（圖1插圖）也顯示了細胞內(nèi)的肌絲與hUASMCs的一致。

2.2 細胞生長曲線

從圖2的生長曲線可以看出，hADSCs在正常培養(yǎng)液中持續(xù)生長，而在其他組，無論是單純的低血清誘導(dǎo)組還是加有生長因子的誘導(dǎo)組，細胞都出現(xiàn)了生長停滯，說明hADSCs的生長活性良好；同時，在加有生長因子的情況下，細胞生長停滯有利于細胞向平滑肌細胞分化。

2.3 hADSCs在TGF-β1和BMP4的作用下平滑肌細胞特異性標(biāo)記物的表達

免疫熒光檢測可以看出，hADSCs在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合誘導(dǎo)作用下，表達平滑肌細胞的特異性蛋白：α-SMA、SM22α、calponin和 SM-MHC。而在正常培養(yǎng)液組盡管可見α-SMA、SM22α的基礎(chǔ)表達，但在生長因子的作用下，這兩個標(biāo)記物的表達有明顯的提高，且只有在聯(lián)合誘導(dǎo)下，才有SM-MHC的表達，這一標(biāo)記物只在平滑肌細胞中表達，從而證明在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合作用下，hADSCs分化成平滑肌樣細胞（圖3）。

為了證明免疫熒光染色的結(jié)果，我們又通過Western-Blot來觀察上述指標(biāo)在蛋白水平的表達情況。從圖4A可以看出，α-SMA、SM22α在正常培養(yǎng)液和單純低血清組也有一定的表達，但只有在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合誘導(dǎo)組，這些特異性蛋白的表達才與陽性對照組相當(dāng)。這與熒光觀察的結(jié)果一樣。同時，為了進一步證明TGF-β1和BMP4對hADSCs的誘導(dǎo)分化作用，我們又采用RT-PCR來檢測這些平滑肌細胞相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達情況。從圖4B可以看出，未分化的hADSCs只表達低水 平 的 α-SMA and SM22αmRNA，TGF-β1 或BMP4單純誘導(dǎo)組可見calponin的表達，而只有兩者聯(lián)合作用組才見SM-MHC的表達與陽性對照組相似。從而在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平證明了在TGF-β和BMP4的聯(lián)合作用下，hADSCs分化成了平滑肌細胞。

2.4 細胞-PGA復(fù)合物的體外及生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)

細胞-PGA復(fù)合物在體外培養(yǎng)7 d，電鏡和激光共聚焦觀察可見大量細胞黏附于材料上，并有大量的細胞外基質(zhì)分泌充填于PGA纖維間，且細胞分布于PGA膜片的各個部位（圖5a-d）。隨著復(fù)合物在反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)，PGA材料逐漸降解，形成管樣組織（圖5e）。培養(yǎng)8周后，形成新生的組織工程化肌管組織。新生組織色澤光亮，質(zhì)地均勻，管腔圓潤，具有一定的彈性和強度（圖5f）。

2.5 組織學(xué)觀察

反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周后，HE染色可見構(gòu)建的組織結(jié)構(gòu)致密，平滑肌纖維排列規(guī)則，分布較均勻，PGA纖維已基本降解。Masson染色可見膠原分泌旺盛且濃密，肌纖維排列整齊，細胞分布規(guī)則，PGA已降解完全。但是未見彈性纖維的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)（圖6A）。同時，我們對構(gòu)建的組織進行免疫組化分析，可以看出細胞在反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周后仍然表達平滑肌細胞的標(biāo)記物，細胞分布均勻規(guī)則（圖6B）。

2.6 膠原定量和生物力學(xué)檢測

反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周構(gòu)建組織的膠原含量達（48.4±6.65）μg/g濕重，而正常的人大隱靜脈的膠原含量為（78.15±5.57）μg/g濕重，達到正常血管的60%。將構(gòu)建的組織沿環(huán)狀面切開，根據(jù)應(yīng)力-應(yīng)變曲線，可以看出反應(yīng)器內(nèi)力學(xué)動態(tài)培養(yǎng)構(gòu)建組織的最大張力達0.63×106Pa，達到了正常人大隱靜脈的65%。8周后，構(gòu)建組織的縫線張力達（0.93±0.04）N，達到正常大隱靜脈的56%（表2）。以上結(jié)果說明，在生物反應(yīng)器內(nèi)力學(xué)刺激的培養(yǎng)下，所構(gòu)建的管樣組織力學(xué)強度達到了正常大隱靜脈的近60%。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察TGF-β1和BMP4對細胞形態(tài)變化的影響Fig.1 Morphology observation of TGF-β1 and BMP4 on inverted phase contrast microscope

圖2 hADSCs在不用培養(yǎng)液中的生長增殖情況Fig.2 Cell proliferation of hADSCs cultured in different media at indicated time points

圖3 免疫熒光染色觀察hADSCs在不同培養(yǎng)條件下作用7 d表達平滑肌細胞特異性蛋白的情況（標(biāo)尺大?。?5 μm；插圖的標(biāo)尺：50 μm）Fig.3 Expression of SMC-specific proteins in hADSCs under different culture conditions for 7 days(Bar scales:25 μm for all figures;50 μm for insets)

圖4 hADSCs在不同培養(yǎng)條件下表達平滑肌細胞特異性蛋白的情況Fig.4 Expression of SMC-specific proteins in hADSCs at the transcript and protein levels

圖5 細胞-PGA復(fù)合物體外培養(yǎng)情況Fig 5 PGA-smooth muscle compound cultured in vitro

A：構(gòu)建組織（a，c，e）和人臍動脈（b，d，f）。 其中 a-b 為 HE 染色，c-d為Masson三色染色，e-f為Gomori醛復(fù)紅染色。箭頭示彈性纖維。標(biāo)尺：100 μmA:Histological characterization of the engineered blood vessel walls(a,c,e).Human umbilical arteries(normal)(b,d,f)were set as positive controls.Section were stained with hematoxylin and eosin(a,b),Masson trichrome staining(c,d),and Gomori staining(e,f).Arrow indicates the elastic fibers.Scale bars:100 μm

圖6 在反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周所構(gòu)建管壁的組織學(xué)特點Fig.6 Histological and immunohistochemical observation at 8 weeks

表2 構(gòu)建組織的生物力學(xué)檢測結(jié)果Table 2 Biochemical detection of constructed vessels

3 討論

隨著自體血管移植技術(shù)的發(fā)展、尤其是人工合成血管（如Dacron、ePTFE等）制備技術(shù)的不斷提升，使臨床修復(fù)直徑大于6 mm血管的成功率大大提高。但是對于直徑小于6 mm的小口徑血管，由于缺乏內(nèi)皮覆蓋，易發(fā)生血栓，造成血管堵塞。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為解決小口徑血管重建的難題提供了可能。但種子細胞來源不足使其很難進入臨床應(yīng)用。本實驗證明，在TGF-β1和BMP4的聯(lián)合誘導(dǎo)作用下，hADSCs表現(xiàn)出平滑肌細胞的形態(tài)，并且表達平滑肌細胞的特異性標(biāo)記物α-SMA、SM22α、calponin和SM-MHC。同時，我們的前期試驗還表明，誘導(dǎo)后的細胞接種于膠原凝膠上出現(xiàn)和正常成熟平滑肌細胞一樣的收縮反應(yīng)。說明hADSCs可作為種子細胞用于構(gòu)建組織工程化血管。

為了使構(gòu)建的組織獲得理想的力學(xué)強度，必須使接種的材料有合適的降解速率。本實驗采用PGA作為支架材料[8]。我們在前期研究中應(yīng)用PGA和成熟平滑肌細胞成功構(gòu)建了大口徑血管壁組織。但是，本實驗應(yīng)用的PGA膜片支架是手工編織的，容易造成PGA纖維的分布不均，從而造成細胞分布不均，構(gòu)建的組織薄厚不均，影響了最終的力學(xué)強度。因此，有待改進技術(shù)以提高PGA膜片支架的一致性和均一性。

研究表明，循環(huán)張力可以明顯提高構(gòu)建的血管組織的力學(xué)強度，降低細胞的程序性死亡[9]，促進細胞的定向排布，增加膠原含量，防止平滑肌細胞的表型改變[10]，從而增加平滑肌細胞的收縮特性。本實驗的結(jié)果顯示，在生物反應(yīng)器內(nèi)動態(tài)刺激下所構(gòu)建的組織工程化平滑肌層，組織學(xué)結(jié)構(gòu)層次清晰，結(jié)構(gòu)致密，膠原含量明顯增加；同時，在動態(tài)力學(xué)的刺激下，新生組織細胞分布有序，膠原濃密，排列規(guī)則。說明適宜的力學(xué)刺激有利于血管組織的形成和細胞適應(yīng)性再塑。該結(jié)果與Seliktar的報道[11]相一致，他們認(rèn)為循環(huán)張力通過過度表達金屬蛋白酶-2可提高基質(zhì)的重塑。同時，我們觀察到，誘導(dǎo)的hADSCs在沒有生長因子的作用下，在生物反應(yīng)器內(nèi)動態(tài)培養(yǎng)8周，仍能維持平滑肌細胞的表型。

本實驗中應(yīng)用的生物反應(yīng)器，主要模擬了血管承受的雙軸張力，即細胞橫斷面上的同向張力和軸向張力。而對于血管承受的流體剪切應(yīng)力，即流動的血液順血流方向作用于腔側(cè)血管內(nèi)皮細胞單位面積上的力，尚無法模擬。因此，需進一步完善生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)，使之能模擬立體剪切應(yīng)力作用，以使其能更完全地模擬體內(nèi)流體作用的環(huán)境。

血管的生長發(fā)育是一個緩慢而復(fù)雜的過程，其生物力學(xué)性能也是隨著血管的不斷生長，在血流的不斷作用下，而逐漸提高的。體外生物反應(yīng)器只是給予細胞-材料復(fù)合物一個更接近的生長環(huán)境，其最終的目的是要回植到體內(nèi)，用于血管缺損的修復(fù)。而體內(nèi)的大環(huán)境才是血管生長成熟的最佳環(huán)境，體內(nèi)的血流刺激才是最有效地作用因素。今后可考慮同時接種血管內(nèi)皮細胞，回植到體內(nèi)，在血流的作用下，使其進一步生長發(fā)育，從而構(gòu)建出更符合生理功能的血管組織。

本實驗結(jié)果表明，hADSCs在TGF-β1和BMP4的作用下可誘導(dǎo)分化為平滑肌細胞，并且誘導(dǎo)的細胞可在三維PGA支架上保持平滑肌細胞的表型。細胞-材料復(fù)合物可在生物反應(yīng)器內(nèi)形成具有一定強度的小口徑血管組織（內(nèi)徑4 mm）。此外，本方法還可能用于構(gòu)建其他小口徑的肌管組織，如輸尿管、膽管和輸卵管等。

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Experimental Study on Tissue Engineered Small-Diameter Blood Vessel Walls Using Adipose Derived Stem Cells

WANG Chen,GUO Fangfang,ZHANG Yun,GONG Lunli,CUI Lei.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011.

ObjectiveTo investigate the feasibility of constructing tissue engineered blood vessel walls in bioreactor using adipose derived stem cells.MethodsAdipose derived stem cells (ADSCs)were obtained from fresh human lipoaspirates,and under the induction of TGF-β1 and BMP4,hADSCs were differentiated into smooth muscle cells,and then the differentiated hADSCs were collected and seeded onto PGA mesh to form cell-PGA constructs.Thereafter,the cell/PGA constructs were cultivated in a bioreactor with the pulsatile radial stress (pulse rate:75/min,radical distension<5%)for 8 weeks.New small diameter blood vessel walls was formed,the constructs were examined histologically and biomechanically and compared with normal blood vessels.ResultsWith induction of TGF-β1 and BMP4 together,hADSCs acquired a SMC morphology,and grew in a"hill and valley"pattern similar to what was observed in primary isolated hUASMCs,with the expression of smooth muscle-specific contractile proteins including α-SMA,SM22α,calponin,and SM-MHC.An elastic small diameter vessel wall(4 mm in diameter)with improved biomechanical strength and well-organized collagenous fibers were engineered by in vitro culture of SMC-differentiated hADSCs on the PGA scaffold in a blood vessel bioreactor.ConclusionhADSCs can serve as a new cell source for SMCs in blood vessel engineering,and an elastic small diameter vessel wall could be engineered in a bioreactor.It is a promising candidate for treating cardiovascular diseases and for blood vessel engineering purposes.

Polyglycolic acid;Adipose derived stem cells;Smooth muscle cells;Blood vessel tissue engineering;Bioreactor.

Q813.1+1

A

1673－0364（2012）05－0249－07

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.003

上海市自然科學(xué)基金（11ZR1420300）。

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

2012年8月7日；

2012年9月22日）