勞景輝，閆文娟，方佳茂，陳偉濱

(1.廣東省微生物研究所，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省華南應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，廣東 廣州 510070；2.廣東迪美生物技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510070；3.廣東環(huán)西生物科技股份有限公司，廣東 揭陽(yáng) 515343)

冬蟲夏草Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora，是線蟲草科（Ophiocordycipitaceae）、線蟲草屬（Ophiocordyceps）的蟲生真菌[1]，寄生于蟲草蝙蝠蛾幼蟲體上，由蟲形菌核（僵蟲）和子座（草部）組成。由于冬蟲夏草具有多種的藥理活性，如抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化和提高免疫力等[2]，一直被視為珍貴的中藥材而得到廣泛的應(yīng)用。但鑒于天然冬蟲夏草對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求高，生長(zhǎng)率低，加之人們對(duì)其需求的日益增加，使得野生的冬蟲夏草資源緊缺，其價(jià)格甚至比黃金還高。因此，以發(fā)酵等方法探索對(duì)冬蟲夏草進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用的新途徑成為了研究的熱點(diǎn)。本文從冬蟲夏草發(fā)酵無(wú)性型菌株的鑒定及篩選、液體發(fā)酵工藝的優(yōu)化、固體發(fā)酵技術(shù)的開(kāi)發(fā)和發(fā)酵產(chǎn)物的評(píng)價(jià)及應(yīng)用等方面對(duì)冬蟲夏草發(fā)酵進(jìn)行了綜述。

1 冬蟲夏草發(fā)酵菌株的研究概況

發(fā)酵研究的關(guān)鍵之一是要采用真正的冬蟲夏草菌株。由于部分早期研究沒(méi)有考慮到冬蟲夏草不適應(yīng)高溫、生長(zhǎng)緩慢等特點(diǎn)，加上其它技術(shù)上的原因，致使部分用于發(fā)酵研究的“冬蟲夏草”菌株其實(shí)只是長(zhǎng)于冬蟲夏草上的其它菌。但隨著對(duì)冬蟲夏草的認(rèn)識(shí)不斷加深及相關(guān)研究技術(shù)的發(fā)展，真正的冬蟲夏草開(kāi)始被廣泛研究。1977年，沈南英開(kāi)始對(duì)冬蟲夏草生態(tài)進(jìn)行研究，2年后成功分離到冬蟲夏草菌種（該菌種的無(wú)性型后被證明為中國(guó)被毛孢）[2]，并于1983年首次發(fā)表了有關(guān)該真菌菌種分離研究的論文[3]。1989年劉錫進(jìn)

王等分離到與沈南英相同的冬蟲夏草菌種無(wú)性型，定名為中國(guó)被毛孢（Hirsutella sinensis X.J.Liu,Y.L.Guo,Y.X.Yu&W.Zeng） 并正式發(fā)表[4]。1999年趙錦等從分子生物學(xué)角度證明冬蟲夏草無(wú)性階段是中國(guó)被毛孢[5]，并于2000年把該鑒定方法申請(qǐng)中國(guó)專利，即鑒別冬蟲夏草的特征性核苷酸序列和方法（CN00114160.0）。2004年蔣毅等認(rèn)為中國(guó)被毛孢與天然冬蟲夏草菌種一致[6]。2005年中國(guó)菌物學(xué)會(huì)再次確認(rèn)冬蟲夏草菌的無(wú)性型是中國(guó)被毛孢。至于冬蟲夏草的有性型名稱，過(guò)去曾長(zhǎng)時(shí)間采用Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.的拉丁學(xué)名，到2007年則變?yōu)镺phiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora[1，7]，中文可譯為中國(guó)線蟲草 （即冬蟲夏草）。本文采用了這一新的拉丁學(xué)名。

近年來(lái)報(bào)道從冬蟲夏草上分離出來(lái)的無(wú)性型有很多，但只有中國(guó)被毛孢（Hirsutella sinensis）經(jīng)接種蝙蝠蛾幼蟲，并完成了從染菌直到長(zhǎng)出子實(shí)體的全過(guò)程，證明是冬蟲夏草的無(wú)性型菌株[8]，而冬蟲夏草頭孢（Cephalosporium dongchongxiacae N.Y.Shen,S.M.Zhang,L.Zeng,X.C.Zhang&S.L.Wei）、蟲草頭孢（Cephalosporium sinensis C.T.Chen）、蝙蝠蛾被毛孢（Hirsutella hepiali C.T.Chen&N.Y.Shen） 和中華束絲孢（Synnematium sinense X.C.Yin&N.Y.Shen） 等也已被證明是中國(guó)被毛孢（H.sinensis）的同物異名[9，10]，而其它更多的發(fā)酵菌株則尚未確定是中國(guó)被毛孢（H.sinensis），因此相關(guān)的研究還需繼續(xù)進(jìn)行，而本文所綜述的發(fā)酵研究，均基于可靠的菌種來(lái)源或其菌株符合冬蟲夏草的生長(zhǎng)規(guī)律。

2 冬蟲夏草液體發(fā)酵的研究概況

菌絲體干重是冬蟲夏草液體發(fā)酵條件及培養(yǎng)基篩選的主要指標(biāo)之一。張忠廣等發(fā)現(xiàn)在pH 5.5、裝量40%、溫度18℃～20℃、轉(zhuǎn)速 100 r·min-1～120 r·min-1、培養(yǎng)時(shí)間 96 h的適宜條件下，以S31培養(yǎng)基和a培養(yǎng)基，對(duì)冬蟲夏草菌進(jìn)行液體發(fā)酵，得到的菌絲干重達(dá)0.028 g·mL-1左右[11]。多糖作為冬蟲夏草的重要有效成分之一，其產(chǎn)量也常被作為實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。全衛(wèi)豐等以產(chǎn)胞外多糖為參考指標(biāo)，對(duì)冬蟲夏草液體發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基配比為蔗糖3%、玉米粉5%、豆餅粉4%、七水硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.1%、維生素B1為0.01%，于22℃、pH 6.5、轉(zhuǎn)速120 r·min-1，搖瓶培養(yǎng)7 d，所得胞外粗多糖產(chǎn)量為5.86 g·L-1[12]；張國(guó)英對(duì)冬蟲夏草無(wú)性型菌株中國(guó)被毛孢進(jìn)行了原生質(zhì)體的紫外誘變育種，以菌絲體濕重和多糖含量為指標(biāo)，篩選出誘變菌株M1069#，通過(guò)鑒定后對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)基單因素實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得出最優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)后得到的菌絲體含量達(dá)6.31 g·瓶-1，多糖含量為12.1%[13]。

近年來(lái)，Dong等對(duì)冬蟲夏草深層發(fā)酵進(jìn)行單因素和正交實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中含有蔗糖、蛋白胨、維生素B、鈣、鋅和碳氮比為12∶1時(shí)是最有利于菌絲體生長(zhǎng)的，而蔗糖、蛋白胨和酵母提取物的最佳濃度分別是50 g·L-1、10 g·L-1和3 g·L-1，經(jīng)過(guò)40 d的發(fā)酵，所得的菌絲體生物量超過(guò)22 g·L-1[14]；隨后，Dong等又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)6株冬蟲夏草菌株的最適生長(zhǎng)溫度范圍是15℃～18℃，超過(guò)21℃時(shí)則生長(zhǎng)緩慢，達(dá)25℃及以上溫度時(shí)便會(huì)停止生長(zhǎng)；而冬蟲夏草的生長(zhǎng)周期即使在最佳條件下，依然相對(duì)較長(zhǎng)，其液體發(fā)酵也經(jīng)歷延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和死亡期，當(dāng)中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期更是長(zhǎng)達(dá)10 d，如果以菌絲體作為目標(biāo)產(chǎn)物，則整個(gè)發(fā)酵周期需25 d～30 d[15]。

3 冬蟲夏草固體發(fā)酵的研究概況

3.1 固體發(fā)酵概述

相對(duì)于液體發(fā)酵技術(shù)，固體發(fā)酵的設(shè)備較為簡(jiǎn)單，而且廢液排放少，有利于減輕環(huán)境污染及生產(chǎn)成本控制，并且其后處理相對(duì)簡(jiǎn)單，只需將發(fā)酵物干燥粉碎即可，可避免液體發(fā)酵技術(shù)工藝復(fù)雜、容易污染和設(shè)備投資大等缺點(diǎn)。另外，固體發(fā)酵對(duì)于某些研究材料來(lái)說(shuō)，可以比液體發(fā)酵的產(chǎn)量有所提高，而且該發(fā)酵方式特別適合于絲狀真菌[16]，因此，真菌的固體發(fā)酵技術(shù)已逐漸得到人們的重視，但有關(guān)冬蟲夏草固體發(fā)酵的研究卻少有報(bào)道。

3.2 冬蟲夏草固體發(fā)酵及其應(yīng)用研究

葛飛等以麥角甾醇含量為指標(biāo)，對(duì)冬蟲夏草無(wú)性型，即中國(guó)被毛孢的固體發(fā)酵進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)固體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基為大米5 g、玉米粉2 g、蠶蛹粉1 g、麥麩2 g，適宜的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度20℃、料水比1∶1.5、料層厚度2 cm，且無(wú)光照時(shí)對(duì)菌絲生長(zhǎng)較為有利，所得菌絲體的麥角甾醇含量較未優(yōu)化的提高了38.6%[17]。Zhang等發(fā)現(xiàn)陳米經(jīng)過(guò)冬蟲夏草菌的發(fā)酵后，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、膳食纖維、維生素E、氨基酸和麥角甾醇等都高于發(fā)酵前的陳米，而且提高了其超氧化物歧化酶的活性，為陳米的有效利用提供了一種新方法[18]；王祥誠(chéng)等利用冬蟲夏草菌來(lái)發(fā)酵蕨渣，生產(chǎn)菌質(zhì)多糖，發(fā)現(xiàn)最佳工藝條件為蕨渣比例85%、基質(zhì)含水量60%、培養(yǎng)溫度22℃，而且基質(zhì)含水量偏低有利于菌絲生長(zhǎng)，如果偏高則菌質(zhì)多糖得率偏高[19]。閆文娟等對(duì)冬蟲夏草固體發(fā)酵物的抗疲勞作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)灌胃喂養(yǎng)冬蟲夏草固體發(fā)酵物水提液的小鼠，負(fù)重游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng)[20]。

4 冬蟲夏草發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量評(píng)價(jià)

王尊生等對(duì)冬蟲夏草菌絲體固體發(fā)酵粉進(jìn)行成分分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵粉中3'-脫氧腺苷、甘露醇的含量明顯高于冬蟲夏草子實(shí)體中相應(yīng)成分的含量；各種氨基酸的含量和水平，與冬蟲夏草子實(shí)體中相應(yīng)的氨基酸的含量和水平相當(dāng)；發(fā)酵粉中的其他化學(xué)成分和冬蟲夏草子實(shí)體中相應(yīng)成分基本一致[21]。丁婷等發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草無(wú)性型菌株發(fā)酵液中核苷類成分分別為腺苷、尿苷、鳥(niǎo)苷，其含量均高于對(duì)照品冬蟲夏草生藥[22]。王英超等對(duì)冬蟲夏草菌液體發(fā)酵過(guò)程中的酶活性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)淀粉酶、糖化酶、中性及酸性蛋白酶的活力均隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加[23]。Li等研究表明，現(xiàn)在對(duì)冬蟲夏草及制品的檢測(cè)指標(biāo)主要有核苷、麥角甾醇、甘露醇和多糖等化合物，而另一種方法則是通過(guò)比對(duì)相應(yīng)組分的化學(xué)圖譜來(lái)對(duì)冬蟲夏草進(jìn)行質(zhì)控，如CE（毛細(xì)管電泳）等，相對(duì)于對(duì)單個(gè)化合物的鑒定，這種方法更為方便可行[24]。

5 小結(jié)與討論

綜上所述，目前對(duì)冬蟲夏草發(fā)酵的研究主要包括菌株的篩選、液體發(fā)酵工藝的摸索、固體發(fā)酵技術(shù)的開(kāi)發(fā)和發(fā)酵產(chǎn)物的評(píng)價(jià)及應(yīng)用幾個(gè)方面，其中確定研究菌株是否是真正的冬蟲夏草無(wú)性型（中國(guó)被毛孢）成為其中最關(guān)鍵的問(wèn)題之一。近年來(lái)，有許多關(guān)于冬蟲夏草發(fā)酵研究的報(bào)道，但當(dāng)中有很多的研究結(jié)果不太一致，如培養(yǎng)溫度的選擇，范圍從18℃～30℃都有報(bào)道，如吳彩琴等的研究[25]；培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短，范圍從48 h～40 d也有報(bào)道，但冬蟲夏草是一種生長(zhǎng)緩慢，且生長(zhǎng)溫度相對(duì)較低的真菌，所以溫度和生長(zhǎng)周期應(yīng)該是其重要的研究考慮因素[15，26]，而很多研究都忽略了這一點(diǎn)，也缺乏對(duì)研究菌株的鑒定，因此，相關(guān)研究的菌株可靠性還需要進(jìn)一步證實(shí)。出現(xiàn)上述情況可能有以下幾個(gè)原因：第一，可能研究菌株并非真正的冬蟲夏草；第二，可能該冬蟲夏草菌株經(jīng)過(guò)改良，已經(jīng)可以適應(yīng)相對(duì)較高的溫度；第三，該實(shí)驗(yàn)可能只在該次實(shí)驗(yàn)條件下成立。對(duì)此，僅對(duì)有可靠菌種來(lái)源或從培養(yǎng)溫度和時(shí)間上符合冬蟲夏草生長(zhǎng)規(guī)律的發(fā)酵研究進(jìn)行綜述。

鑒于冬蟲夏草對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境和培養(yǎng)條件的苛刻要求，分離出真正的菌種是非常關(guān)鍵的，而目前人們對(duì)冬蟲夏草的研究主要是集中于其藥理活性的開(kāi)發(fā)，各種與冬蟲夏草相關(guān)的制品在保健品市場(chǎng)隨處可見(jiàn)，如百令膠囊、金水寶膠囊、寧心寶膠囊、至靈膠囊和心肝寶膠囊等。但研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)中某些產(chǎn)品的確是用冬蟲夏草的無(wú)性型來(lái)生產(chǎn)的，但也有一些是來(lái)源于天然冬蟲夏草菌菌體上分離到的其它菌類，并非真正的冬蟲夏草菌[27]。當(dāng)然并不否認(rèn)，從冬蟲夏草菌體上分離到的某些非冬蟲夏草無(wú)性型的其它真菌也會(huì)有很好的保健或藥用功效，如蝙蝠蛾擬青霉。但從科學(xué)的角度來(lái)看，這些研究與真正的冬蟲夏草菌種關(guān)系不甚密切。所以，進(jìn)行對(duì)冬蟲夏草的研究之前，對(duì)研究菌株進(jìn)行鑒定是很有必要的。分子生物學(xué)方法是鑒定冬蟲夏草無(wú)性型的有效方法之一[9]，只要能以科學(xué)的態(tài)度去對(duì)待研究及生產(chǎn)上所采用的“冬蟲夏草”菌種問(wèn)題，通過(guò)分子生物學(xué)等技術(shù)手段，則可對(duì)冬蟲夏草的發(fā)酵研究有更深入的認(rèn)識(shí)。

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