豐玫玫 蘇文琴

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結(jié)核分枝桿菌診斷技術(shù)的發(fā)展及目前臨床應(yīng)用的新型診斷技術(shù)產(chǎn)品分析

豐玫玫1蘇文琴2

1.?？诰S瑅璦生物研究院，海南?？?570311；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南?？?571199

快速準(zhǔn)確地診斷出結(jié)核分枝桿菌感染是控制和治療結(jié)核病的前提和關(guān)鍵。多年來(lái)，結(jié)核桿菌的診斷技術(shù)在不斷地發(fā)展和創(chuàng)新，近年來(lái)，一些針對(duì)結(jié)核桿菌檢測(cè)的新方法陸續(xù)被報(bào)道，一些新型的診斷技術(shù)產(chǎn)品也陸續(xù)上市。本資料綜述了結(jié)核桿菌的主要診斷方法，并對(duì)目前國(guó)際市場(chǎng)上廣泛應(yīng)用的商業(yè)化診斷技術(shù)產(chǎn)品進(jìn)行了簡(jiǎn)要分析。

結(jié)核分枝桿菌；診斷技術(shù)；分析

結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起結(jié)核病的病原菌，可侵犯全身各器官，以肺結(jié)核最多見(jiàn)。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，目前全球有1/3約20億人被感染，每年新增結(jié)核病感染者約800萬(wàn)，至少有300萬(wàn)人死于該病。因此，要有效地控制和治療結(jié)核病，準(zhǔn)確的診斷是前提和關(guān)鍵，只有準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌的感染或感染的狀態(tài)，才能為臨床對(duì)癥治療提供依據(jù)。盡管結(jié)核分枝桿菌的診斷技術(shù)在不斷地發(fā)展，檢測(cè)方法和診斷產(chǎn)品很多，但各有缺點(diǎn)或不足，難以完全滿(mǎn)足臨床檢測(cè)的需求，因此，新型結(jié)核桿菌診斷技術(shù)及產(chǎn)品的研發(fā)勢(shì)在必行。

1 結(jié)核分枝桿菌診斷技術(shù)的發(fā)展

1.1 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)是目前唯一確診結(jié)核病的方法，主要有痰涂片法和培養(yǎng)法。近年來(lái)，盡管結(jié)核病的診斷技術(shù)在不斷地創(chuàng)新，但細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)法在結(jié)核病的診療中仍然占有很重要的位置。

1.1.1 痰涂片法 痰涂片是應(yīng)用歷史最久，也是臨床最常見(jiàn)細(xì)菌學(xué)方法，是發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核傳染源的直接手段。主要有抗酸染色法、熒光染色法和聯(lián)染法，涂片具有快速、簡(jiǎn)便、價(jià)廉等特點(diǎn)，但靈敏度低、特異性差，對(duì)早期非排菌感染者的診斷不適用，且診斷結(jié)果易受實(shí)驗(yàn)室客觀(guān)條件的影響。

1.1.2 培養(yǎng)法 該方法是通過(guò)在培養(yǎng)基上對(duì)樣本培養(yǎng)，然后根據(jù)結(jié)核分枝桿菌初生長(zhǎng)的時(shí)間、菌落形態(tài)以及是否產(chǎn)色素等特點(diǎn)，加以診斷，是目前檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在結(jié)核病細(xì)菌學(xué)診斷方面具有決定性的意義。缺點(diǎn)是周期長(zhǎng)，檢驗(yàn)結(jié)果嚴(yán)重滯后診斷，難以滿(mǎn)足臨床需要。

1.2 免疫學(xué)方法

1.2.1 結(jié)核菌素試驗(yàn) 結(jié)核菌素試驗(yàn)，也稱(chēng)PPD試驗(yàn)，是一種傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷試驗(yàn)，用一定濃度的結(jié)核菌素注射到待檢者前臂掌側(cè)皮內(nèi)，48～72 h后根據(jù)注射部位有無(wú)硬節(jié)，及硬節(jié)大小作為結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)，主要用作結(jié)核病的輔助診斷、卡介苗接種效果以及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)的檢測(cè)。反應(yīng)的出現(xiàn)主要是細(xì)胞免疫參與反應(yīng)，但也有體液免疫參與。該法目前仍在許多國(guó)家使用，缺點(diǎn)是假陽(yáng)性率高、不易標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.2 免疫血清學(xué)檢測(cè) 人體感染結(jié)核分枝桿菌后，會(huì)產(chǎn)生一系列體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并明顯表現(xiàn)為體液免疫與細(xì)胞免疫分離的現(xiàn)象[1]。體液免疫的作用方式是通過(guò)效應(yīng)B細(xì)胞分泌抗體，并與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合來(lái)清除抗原，而細(xì)胞免疫則是通過(guò)效應(yīng)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子使靶細(xì)胞溶解死亡。

結(jié)核桿菌的體液免疫檢測(cè)既可用已知的結(jié)核抗原來(lái)測(cè)定未知的結(jié)核抗體，也可用已知的結(jié)核抗體來(lái)測(cè)定未知的結(jié)核抗原，此外，還可以檢測(cè)免疫復(fù)合物。因此，基于體液免疫檢測(cè)的種類(lèi)有檢測(cè)結(jié)核抗體、檢測(cè)結(jié)核抗原、檢測(cè)免疫復(fù)合物。

基于細(xì)胞免疫反應(yīng)的診斷技術(shù)是診斷結(jié)核分枝桿菌感染的新方向，這種技術(shù)的產(chǎn)生得益于結(jié)核分枝桿菌基因組學(xué)和免疫學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展。其基本原理為，機(jī)體被結(jié)核桿菌感染后，存在于體內(nèi)的記憶性T細(xì)胞會(huì)對(duì)體外特異性抗原的刺激做出積極反應(yīng)，表現(xiàn)為特定細(xì)胞因子的釋放和細(xì)胞因子譜的變化。通過(guò)對(duì)這些細(xì)胞因子進(jìn)行定量分析，達(dá)到診斷結(jié)核感染狀態(tài)的目的。這一技術(shù)正在結(jié)核相關(guān)疾病的診斷中顯示出其特有的優(yōu)勢(shì)，已成為國(guó)際上關(guān)注的熱點(diǎn)，有可能在結(jié)核防控領(lǐng)域產(chǎn)生革命性的變革。因?yàn)樵摷夹g(shù)具有高敏感性和高特異性，并且不受卡介苗和大多數(shù)非致病分枝桿菌的影響。目前該技術(shù)已經(jīng)在健康人中潛伏性感染風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估、免疫抑制人群中潛伏性感染的診斷、免疫治療前結(jié)核桿菌感染的篩查、活動(dòng)性結(jié)核和潛伏性結(jié)核的鑒別診斷、活動(dòng)性結(jié)核發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)等臨床領(lǐng)域表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值，并具有巨大的市場(chǎng)潛力。

目前，應(yīng)用到臨床檢測(cè)的是γ-干擾素釋放分析技術(shù)（interferon gamma release assay，IGRA），該技術(shù)是對(duì)全血或單核細(xì)胞在結(jié)核桿菌特異性抗原刺激后產(chǎn)生的γ-干擾素進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)槭艿娇乖碳ざ旅舻腡細(xì)胞再次遇到同類(lèi)抗原時(shí)能產(chǎn)生γ-干擾素，因此可以判斷機(jī)體是否存在潛伏結(jié)核感染。無(wú)論是基于體液免疫反應(yīng)的檢測(cè)還是細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測(cè)，所使用的檢測(cè)方法基本相同，主要有以下幾種。

1.2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 該法是利用抗原與抗體可進(jìn)行特異性反應(yīng)的原理，進(jìn)行定量檢測(cè)的方法，該法1974年建立。1976年Nassau等首先將ELISA用于血清結(jié)核抗體的檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)原理的不同，可將ELISA分為間接法、夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法3類(lèi)，是目前較為成熟的血清學(xué)輔助診斷方法。但該法會(huì)因觀(guān)察對(duì)象、檢測(cè)抗原的不同質(zhì)控等因素，結(jié)果差異較大[2]。

1.2.2.2 免疫印跡技術(shù) 免疫印跡技術(shù)，是Southern等于1975年建立的一種特異性抗原、抗體檢測(cè)技術(shù)，是SDS-PAGE技術(shù)與高敏感性的酶聯(lián)免疫技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。1986年Coates SR等[3]首先將免疫印跡技術(shù)用于結(jié)核病人血清抗體水平的檢測(cè)，結(jié)果表明本法對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病人的診斷具有很高的價(jià)值。

1.2.2.3 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT） 20世紀(jì)80年代中期，Sedgwick JD等[4]和Czerkinsky CA等[5]根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和CK分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）。該技術(shù)可以在單細(xì)胞水平上進(jìn)行細(xì)胞因子的檢測(cè)，對(duì)結(jié)核病的早期診斷意義重大。由于該方法具有較高的特異性和敏感性，且客觀(guān)、易操作、易自動(dòng)化。如果能區(qū)分潛伏和活性感染，將具有更高的臨床應(yīng)用價(jià)值，但缺點(diǎn)是所用儀器和試劑較昂貴。

1.2.2.4 金標(biāo)免疫斑點(diǎn)法 該技術(shù)是20世紀(jì)80年代中后期發(fā)展的一種新型免疫學(xué)標(biāo)記和檢測(cè)技術(shù)，九十年代起在結(jié)核病血清學(xué)診斷中得以應(yīng)用。免疫金標(biāo)技術(shù)是在免疫斑點(diǎn)檢測(cè)原理的基礎(chǔ)上用膠體金標(biāo)記替代了酶標(biāo)記，可以用于定性或半定量檢測(cè)，由于該法操作簡(jiǎn)便、快速，并可單人份檢測(cè)，因此深受歡迎。缺點(diǎn)是不能定量，敏感性和特異性低。

1.3 分子生物學(xué)方法

隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，其在結(jié)核病領(lǐng)域的研究和應(yīng)用也逐漸深入。結(jié)核病的基因診斷、耐藥性測(cè)定、菌種的分子

生物學(xué)鑒定等均取得了重大進(jìn)展。目前，研究、應(yīng)用報(bào)道較多的方法主要有如下幾種。

1.3.1 核酸探針?lè)?核酸探針?lè)ǖ幕驹硎抢靡阎暮怂崽结槞z測(cè)結(jié)核分枝桿菌核酸樣品中的特定基因序列。核酸探針是一項(xiàng)很有前途的檢測(cè)技術(shù)，它可以鑒定不同種群的分枝桿菌，有助于結(jié)核病的鑒別診斷。其顯著優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)[6]，缺點(diǎn)是直接檢測(cè)臨床標(biāo)本的敏感性較低，因此，目前核酸探針?lè)ê苌儆糜谂R床診斷。

1.3.2 PCR技術(shù) 1989年Hance AJ等[7]首先將PCR用于結(jié)核分支桿菌的檢測(cè)。PCR是一項(xiàng)良好的實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)，具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、可自動(dòng)化、通量化等特點(diǎn)，這對(duì)于因排菌量少或因結(jié)核桿菌發(fā)生L型變異，常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法不易診斷的患者，鑒別診斷及化療后排菌情況的觀(guān)察，具有很高的臨床診斷價(jià)值。但常規(guī)PCR易引起產(chǎn)物交叉污染，結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。為克服PCR檢測(cè)技術(shù)的不足，近年來(lái)科研人員對(duì)其進(jìn)行不斷創(chuàng)新和發(fā)展，新的PCR及其衍生技術(shù)不斷被建立，如2007年，Agacayak A等[8]研究報(bào)道的PCR-RFLP（聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析）；1993年，Higuchi R等[9]報(bào)告提出了Real-Time PCR（實(shí)時(shí)定量熒光PCR），2008年，Takahashi T等[10-11]研究報(bào)道的定量巢氏PCR方法等。此外，還有PCR-SSCP技術(shù)、PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)、PCR-基因芯片分析法、RNA/RNA錯(cuò)配法、分子燈塔法（molecular beacon）、PCR-雙脫氧指紋圖譜（PCR-ddF）等。盡管該技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn)，但在臨床檢測(cè)中如果操作不慎，易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，不能區(qū)分死菌與活菌。

1.3.3 DNA序列測(cè)定 DNA序列測(cè)定，是用PCR的方法擴(kuò)增待測(cè)基因，測(cè)序后與其標(biāo)準(zhǔn)株的同一片段進(jìn)行比對(duì)。DNA測(cè)序是菌種鑒定和檢測(cè)基因突變的“金標(biāo)準(zhǔn)”，不僅能夠用于突變的檢測(cè)，而且能夠確定突變的部位與性質(zhì)。但該法操作繁瑣，費(fèi)用昂貴，因此限制了它的臨床推廣應(yīng)用，目前多用于評(píng)價(jià)其他檢測(cè)方法的參考方法或與其他方法結(jié)合應(yīng)用。

1.3.4 基因芯片技術(shù) 基因芯片始創(chuàng)于90年代初，又稱(chēng)DNA芯片，是近年發(fā)展起來(lái)的進(jìn)行大規(guī)模遺傳多態(tài)性檢測(cè)的新方法，是目前分子生物學(xué)最前沿的方法。系指將多種探針固定在基片上，與待檢標(biāo)本中標(biāo)記的DNA或RNA進(jìn)行分子雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。1999年Troesch A等[12]開(kāi)發(fā)出首塊結(jié)核病相關(guān)芯片。該技術(shù)在基因分析時(shí)具有快速、準(zhǔn)確、高通量、高信息量的優(yōu)勢(shì)，在結(jié)核分枝桿菌診斷、菌種鑒定、、耐藥性分析等方面發(fā)揮著重要的作用，但由于儀器昂貴和制備芯片成本偏高因素等限制了其在臨床診斷中的廣泛應(yīng)用。

1.3.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 2000年日本學(xué)者Notomi T等[13]建立了一種新的體外擴(kuò)增特異DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。該技術(shù)依賴(lài)于自動(dòng)循環(huán)的鏈置換反應(yīng)，對(duì)儀器設(shè)備要求低，一臺(tái)水浴鍋或恒溫箱就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)，結(jié)果的檢測(cè)也很簡(jiǎn)單，通過(guò)肉眼觀(guān)察即可判斷，而且特異性強(qiáng)、靈敏度高，適合基層快速診斷。受到了WHO、各國(guó)學(xué)者和相關(guān)政府部門(mén)的關(guān)注，短短幾年，該技術(shù)已成功地應(yīng)用于多種病菌的檢測(cè)中，包括結(jié)核桿菌的檢測(cè)，目前已有相關(guān)的檢測(cè)產(chǎn)品上市，有望成為臨床上常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)。

1.4 噬菌體裂解技術(shù)

盡管1947年Gardner就分離出了分枝桿菌噬菌體，但用噬菌體裂解法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌還是一個(gè)新的領(lǐng)域，該技術(shù)的基本原理是：分枝桿菌噬菌體只能感染活的結(jié)核分枝桿菌，該噬菌體與待檢樣品混合孵育后，侵入活的結(jié)核分枝桿菌體內(nèi)，隨后加入殺毒劑殺死培養(yǎng)基內(nèi)所有游離的噬菌體，而侵入結(jié)核分枝桿菌內(nèi)的噬菌體大量繁殖，并裂解菌體釋放出來(lái)，釋放出來(lái)的噬菌體可感染和裂解隨后加入的指示菌（恥垢分枝桿菌），在培養(yǎng)基上形成噬菌斑，由此只需根據(jù)培養(yǎng)基上的噬菌斑的有無(wú)，就可判斷標(biāo)本中是否存在活的結(jié)核分枝桿菌[14]，而且噬菌斑的數(shù)目與結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量成正比。該法可鑒別死、活菌，特別是在結(jié)核桿菌藥敏感實(shí)驗(yàn)方面另辟蹊徑。且該方法簡(jiǎn)單、易操作、儀器設(shè)備要求低、成本低廉，易于推廣。

2 目前臨床應(yīng)用的新型診斷技術(shù)產(chǎn)品分析

隨著科技的發(fā)展和學(xué)科間的交叉應(yīng)用，世界各國(guó)相關(guān)領(lǐng)域的科研工作者們?cè)诓粩嗟靥剿?，使得結(jié)核桿菌的診斷方法得到了不斷的改進(jìn)和創(chuàng)新，許多性能更好、更加方便臨床應(yīng)用的新型結(jié)核桿菌診斷技術(shù)和產(chǎn)品逐漸上市[15-17]。WHO和FDA也逐步認(rèn)可了一些性?xún)r(jià)比較好、且已廣泛應(yīng)用的商業(yè)化診斷技術(shù)產(chǎn)品，如基于液體培養(yǎng)法的由法國(guó)生物梅里埃公司研制的BacT/Alert 3D檢測(cè)系統(tǒng)、美國(guó)BD公司研制的BACTECTM MGITTM960系統(tǒng)、基于核酸分子擴(kuò)增技術(shù)的由瑞士Roche公司研發(fā)的Amplicor MTB試劑盒、美國(guó)芝加哥Abbott實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)出半自動(dòng)商品化LCR診斷試劑盒、美國(guó)Gene-Trak公司研制的全自動(dòng)QB復(fù)制酶擴(kuò)增包裝試劑盒、美國(guó)Gen-Probe公司發(fā)展起來(lái)的Gen-Probe結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)分析系統(tǒng)AMTDT、美國(guó)BD公司的BDProbeTec SDA系統(tǒng)、美國(guó)Cepheid公司依據(jù)熒光定量PCR的原理開(kāi)發(fā)的Xpert MTB/RIF系統(tǒng)、澳大利亞ICT公司基于免疫色譜技術(shù)的Capilia TB試劑盒研發(fā)的ICTTB測(cè)試卡；英國(guó)Oxford Immunotec公司基于細(xì)胞免疫反應(yīng)的γ-干擾素釋放分析技術(shù)生產(chǎn)T-SPOT.TB試劑盒和澳大利亞Cellestis公司研發(fā)的QuantiFERON-TB Gold、日本榮研公司與FIND合作基于LAMP技術(shù)研發(fā)的肺結(jié)核LAMP診斷試劑盒，還有基于噬菌體裂解技術(shù)由英國(guó)Biotec Laboratories Ltd公司研發(fā)生產(chǎn)的FASTPlaqueTBTM試劑盒。

目前國(guó)內(nèi)通過(guò)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市的結(jié)核分枝桿菌診斷試劑盒產(chǎn)品有40多個(gè)，這些產(chǎn)品的檢測(cè)方法主要集中在酶聯(lián)免疫法、PCR法、膠體金法、基因芯片法等，2011年，國(guó)內(nèi)首款基于γ-干擾素釋放分析技術(shù)的試劑盒產(chǎn)品也正式上市。

3 結(jié)論

由于結(jié)核分枝桿菌染色體變異的多樣性和多耐藥結(jié)核桿菌的出現(xiàn)，有時(shí)用一種方法難以檢測(cè)或鑒定出所感染的菌株，因此還需要揚(yáng)長(zhǎng)避短，幾種方法聯(lián)合使用。此外，目前尚無(wú)一種診斷技術(shù)或產(chǎn)品可嚴(yán)格區(qū)分出潛伏性感染和活動(dòng)性結(jié)核，因此更敏感、更快捷、可區(qū)分潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的新型診斷技術(shù)或產(chǎn)品的研發(fā)，仍然任重道遠(yuǎn)。

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Advance in diagnosis techniques of Mycobacterium tuberculosis and analysis of new diagnostic technologies and products in clinical application

FENG Meimei1SU Wenqin2
1.Haikou VTI Biological Institute,Haikou 570311,China;2.Department of Pharmacy,Hainan Medical College,Haikou 571199,China

Fast and accurate diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection is the key and prerequisite to control and treatment tuberculosis.For many years,the diagnostic techniques of Mycobacterium tuberculosis have been developing and innovating.In recent years,some new techniques for Mycobacterium tuberculosis detection were reported and some new diagnostic products have been listed.This paper reviewed the main diagnosis techniques of Mycobacterium tuberculosis,and analysed briefly the commercialized diagnostic products which are used widely in the international market now.

Mycobacterium tuberculosis;Diagnosis;Analysis

R378.91；R446.5

A

2095-0616（2012）12-26-03

2012-04-25）