王立威，孫玉學(xué)，張 博，黃海燕，吳宣萱＊

（1.長春市人民醫(yī)院 伽瑪?shù)吨行模?長春130051；2.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 神經(jīng)腫瘤外科，吉林 長春130021）

腦膠質(zhì)瘤起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是最常見的顱內(nèi)腫瘤，有逐年增長的趨勢(shì)。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的平均存活期小于15個(gè)月［1］。數(shù)十年來，盡管手術(shù)治療、放射治療以及生物化學(xué)治療在臨床上普及應(yīng)用，但是患者的生存期未見明顯延長［2］。1987年，Johnstone等首次用exosome來描述網(wǎng)織紅細(xì)胞分泌的這種囊性小泡，這種囊性小泡在網(wǎng)織紅細(xì)胞的最后階段把不必要的膜成分排除胞外［3］。后來陸續(xù)發(fā)現(xiàn) B細(xì)胞［4］、T 細(xì)胞［5］、樹突狀細(xì)胞［6］、腫瘤細(xì)胞均可分泌exosome，腫瘤患者的血清、腹水、胸水等亦有exosome，特別是膠質(zhì)瘤細(xì)胞源性exosome含有 mRNA、miRNA［7］、線粒體DNA、熱休克蛋白（HSPs90，70，60和27）、EGFRvIII和 TGF－1［8］等生物大分子，具有重要的研究意義。腫瘤源性exosome含有這些特殊的分子物質(zhì)，對(duì)闡述線粒體疾病有一定的意義，可推動(dòng)腫瘤的免疫治療。

1 Exosome概述

Exosome，又稱外切酶體、微粒體，起源于晚期核內(nèi)體，由30－100μm大小的小囊泡在多聚體內(nèi)（MVBs）聚集而成［9］。多數(shù)多聚體被溶酶體酶水解；一部分多聚體與細(xì)胞質(zhì)膜融合釋放小囊泡到細(xì)胞外，形成exosome。細(xì)胞通過釋放exosome來排出胞內(nèi)的毒性物質(zhì)，包括殘留的化學(xué)治療劑，病毒以及信使RNA和微小RNA［10］。Graner，M.W.等已經(jīng)證實(shí)人類與鼠的膠質(zhì)瘤細(xì)胞都可以分泌exosome［11］。在癌癥病人的惡性滲出液［12］、腹水［13］以及血清［14］中也存在 exosome。Michael W.Graner［8］等人通過電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤源性exosome是由50－100納米的囊性小泡組成的，含有熱休克蛋白。Michele Guescini等人研究證實(shí)了exosome還有線粒體DNA［15］。下面我們從三個(gè)方面來探討膠質(zhì)瘤源性的exosome的生物學(xué)性質(zhì)、相應(yīng)的功能以及對(duì)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的實(shí)踐意義。

2 Exosome蛋白質(zhì)組學(xué)研究

蛋白質(zhì)組學(xué)，早在1995年由Marc Wilkins提出這一概念［16］。經(jīng)過十余年的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)已發(fā)展為通過雙向凝膠電泳、生物質(zhì)譜技術(shù)以及生物信息學(xué)等方法在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)特征（包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白相互作用）的一門學(xué)科，用于蛋白質(zhì)的鑒定，研究蛋白質(zhì)功能，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生、細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識(shí)。

Hiratsuka等 利 用 2－DE 和 MALDI－TOF－MS技術(shù)，在膠質(zhì)瘤中鑒定出了11種上調(diào)的蛋白質(zhì)和一種下調(diào)的細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白－SIRT2。Honda等應(yīng)用非平衡PH梯度凝膠電泳分離多個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的水溶性蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人和鼠的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系蛋白圖譜存在顯著不同。Iwadate等應(yīng)用2－DE和MALDI－TOF－MS技術(shù)對(duì)膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行分析，根據(jù)2－DE結(jié)果對(duì)膠質(zhì)瘤的蛋白表達(dá)譜進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)聚類分析的結(jié)果與病人生存率和生存時(shí)間有明顯的相關(guān)性，進(jìn)行 MALDI－TOF－MS分析，鑒定了25種蛋白質(zhì)，分別屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、分子伴侶蛋白等。Michael W.Graner等人用二維聚丙烯凝膠電泳研究膠質(zhì)瘤源性exosome和SMA560vIII源性exosome所含蛋白質(zhì)［8］，根據(jù)其在電解槽中不同的移動(dòng)速度分離出45種蛋白質(zhì)，包括HSC90、70、60、27，與免疫相關(guān)的抗PDI抗體、肌動(dòng)蛋白、CD171、CD40、干擾素、白介素6、白介素1，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的DNA／RNA蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、分子伴侶、蛋白酶或者蛋白酶抑制劑，特異的蛋白質(zhì)包括抑制蛋白2，3－DPGH、凋亡蛋白、CENP－P （#26）、唾液酸合酶、eIF3、PCNA、MT 磷酸酶、EF－1、蛋白酶體和ALIX（一種蛋白質(zhì)，exosome的標(biāo)記蛋白）。研究結(jié)果顯示，其含的蛋白質(zhì)有的跟人類H2159MG exosome所含蛋白質(zhì)相同，一部分為其自身所特有。Johan Skog［17］等人通過研究發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤患者exosome中含有血管源性蛋白。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示了膠質(zhì)瘤源性exosome蛋白質(zhì)大多數(shù)是多功能蛋白質(zhì)，具有酸性等電點(diǎn)，是與酶及新陳代謝有關(guān)的物質(zhì)。這些蛋白質(zhì)大部分是低聚復(fù)合物，分別是大分子蛋白、TCP－1／HSP60、蛋白酶體、肌動(dòng)蛋白、微管蛋白、40S的核糖體蛋白、延長因子、轉(zhuǎn)化因子、鐵蛋白以及糖酵解中的四種酶。NF－κB和ApoA－1的關(guān)系在脂質(zhì)的新陳代謝中起著重要作用［25］。ApoA－1通過exosome運(yùn)送到各種細(xì)胞或者從細(xì)胞中釋放，都受控于NF－κB的狀態(tài)和細(xì)胞脂質(zhì)的生物化學(xué)性質(zhì)。烯醇酶和肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞表面血纖維蛋白溶原酶和血管生成抑制因子的受體。烯醇酶和生長因子的關(guān)系，說明生長因子可能與糖酵解相關(guān)的蛋白有相關(guān)性，生長因子對(duì)糖酵解有一定的影響。這些蛋白質(zhì)低聚復(fù)合物是由exosome體內(nèi)的蛋白質(zhì)聚集而成的。有文獻(xiàn)報(bào)道，很多病毒蛋白與exosome蛋白相似，很難區(qū)分病毒顆粒與exosome。有學(xué)者從膠質(zhì)瘤患者中發(fā)現(xiàn)了人巨細(xì)胞病毒，在外周血中發(fā)現(xiàn)了HCMV DNA［26］。有人推測(cè)來自膠質(zhì)瘤患者的HCMV DNA可能來自exosome，有待研究。

Michael W.Graner等［8］人用Ingenuity軟件分析了其蛋白質(zhì)路徑，最高的兩種被描述為“血液的、免疫的、呼吸系統(tǒng)的疾病”和“細(xì)胞間信號(hào)傳遞、癌癥、血液病學(xué)的發(fā)展”。結(jié)果證明，不同來源exosome蛋白質(zhì)之間有密切的關(guān)系，同時(shí)有很多信號(hào)蛋白存在于腫瘤細(xì)胞中，特別是腦腫瘤，并發(fā)現(xiàn)很多exosome蛋白與免疫有關(guān)，如CD40、干擾素、白介素6、白介素1。這些相關(guān)性凸顯了exosome存在著正常和病理兩種細(xì)胞狀態(tài)。

3 Exosome免疫學(xué)研究

通過對(duì)膠質(zhì)瘤源性exosome所含蛋白質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，其中很多蛋白質(zhì)是與免疫有關(guān)的蛋白質(zhì)，如HSP、EGFRvII、CD40、干擾素、白介素6和白介素1。

Exosome表面HSP有助于抗原提呈細(xì)胞或者自然殺傷細(xì)胞的免疫反應(yīng)；另一方面，細(xì)胞表面HSP2724與腫瘤的浸潤性生長有關(guān)，所以關(guān)于exsome表面HSP的研究越來越受關(guān)注。HSP27存在于exosome的表面，exosome類似于細(xì)胞，細(xì)胞表面蛋白能變成exosome表面蛋白。如果exosome能隨血液或者腦脊液在體內(nèi)流動(dòng)，那么Exosome表面的HSP27，同時(shí)也可作為腫瘤表面抗原，亦可作為腫瘤標(biāo)記。從膠質(zhì)瘤患者血清中分離出exosome，證明了exosome含有EGFR和EGFRvIII、HSP／HSC70、TGF－＿1。EGFRvIII和 TGF－＿1用于區(qū)別是來自腫瘤源性的exosome還是來自病人的血清，亦可作為腫瘤標(biāo)記。Exosome可以在尿液和羊水中提取，可以用exosome含有的核酸作標(biāo)記。

從病人和正常人血清中分離出的exosome含有EGFR，而從膠質(zhì)瘤患者exosome中可發(fā)現(xiàn)EGFRvIII，在正常人血清中是不存在的。正常人的exosome含有HSP／HSC70和EGFR，不含EGFRvIII和TGF－＿1。TGF是一免疫調(diào)節(jié)因子。EGFRvIII這種變異的受體容易被激活而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，同時(shí)可作為腫瘤抗原，引起相關(guān)免疫反應(yīng)［18］。EGFR－vIII和TGF－＿1是膠質(zhì)瘤所特有的，可作為生物標(biāo)記，同時(shí)它們具有免疫特性，包括抗原性和抑制免疫。EGFRvIII抗原有利于分析膠質(zhì)瘤產(chǎn)生exosome的過程，也可使我們?cè)隗w外建立膠質(zhì)瘤產(chǎn)生exosome的模型。EGFRvIII可以根據(jù)相關(guān)信號(hào)的激活路徑轉(zhuǎn)移到不含EGFRvIII的超微小泡中去。

很多報(bào)道稱腫瘤源性的exosome具有免疫抑制力［19］，TGF在免疫抑制中起重要作用，免疫抑制的靶細(xì)胞包括自然殺傷細(xì)胞［20］，效應(yīng) T 細(xì)胞［21］，抗原提呈細(xì)胞［22］。高度惡性膠質(zhì)瘤患者的免疫系統(tǒng)是受到抑制的，推測(cè)exosome可能跟免疫抑制有關(guān)。免疫抑制和免疫促進(jìn)的平衡點(diǎn)取決于exosome，免疫反應(yīng)是由內(nèi)在和外在的因素共同決定的。Exosome的抗原和免疫刺激是很重要的，但更重要的是免疫調(diào)節(jié)功能，比如FAS配體、脂肪、病毒，甚至TGF調(diào)節(jié)因子。Michael W.Graner等［8］人通過對(duì)鼠的研究發(fā)現(xiàn)，exosome實(shí)際上能產(chǎn)生免疫刺激，包括T細(xì)胞和抗體的產(chǎn)生，但不能延長鼠的存活期?；铙w中的exosome能產(chǎn)生抗體。但是，如果很難接近腫瘤組織，或者有一種類似腫瘤的組織來結(jié)合抗體，這樣就不能起到抗腫瘤的作用。因此，在這種情況下，exosome產(chǎn)生的免疫反應(yīng)不足以抑制腫瘤的發(fā)生。也有報(bào)道稱exosome能引起保護(hù)性抗體反應(yīng)，抑制腫瘤表達(dá)SARS病毒蛋白，這些exosome都來自在經(jīng)抗病毒免疫的人類細(xì)胞株［23］?？贵w的產(chǎn)生以及細(xì)胞毒性T細(xì)胞的減少有益于腫瘤的治療。膠質(zhì)瘤源性exosome具有抗炎的作用和產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用，能減少腫瘤免疫反應(yīng)，能夠給我們提供新的治療方法治療嚴(yán)重的疾患。

4 Exosome分子生物學(xué)研究

Exosome，亦稱外切體，是因?yàn)樵诮湍钢械膃xosome具有一個(gè)具有3’，5’－外切核酸酶活性的復(fù)合物，參與了多條RNA的代謝途徑，包括mRNA和pre－mRNA的周轉(zhuǎn)，5.8sRNA的加工，多種snRNA及snoRNA的加工等［28］，在膠質(zhì)瘤exosome中尚未發(fā)現(xiàn)。Johan Skog等［17］人研究證實(shí)了惡性膠質(zhì)瘤患exosome含有 mRNA，miRNA。Michael W.Graner等［11］人在膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的exosome中發(fā)現(xiàn)了與RNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)的起始因子和延長因子eIF3，EF－1。Michele Guescini等人［27］通過PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了exosome中含有線粒體DNA，這些與基因有關(guān)的分子的發(fā)現(xiàn)將會(huì)開啟膠質(zhì)瘤新的研究方向。

在膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)對(duì)基因研究有重要意義，mRNA和miRNA可作為基因探針或腫瘤標(biāo)記，有助于膠質(zhì)瘤的診斷。Exosome中的線粒體DNA有望成為基因克隆的載體，制備腫瘤疫苗，有待于進(jìn)一步研究。Exosome中是否含有線粒體蛋白質(zhì)尚不清楚，但Staubach［29］已在乳腺癌exosome中發(fā)現(xiàn)了線粒體蛋白質(zhì)。

4 展望

自從發(fā)現(xiàn)exosome以來，人們對(duì)它的研究從未間斷，希望通過對(duì)膠質(zhì)瘤源性exosome的研究為膠質(zhì)瘤治療提供新的方法。目前，樹突狀細(xì)胞性exosome作為細(xì)胞疫苗已進(jìn)入第一臨床階段實(shí)驗(yàn)。膠質(zhì)瘤源性的exosome，是一種亞細(xì)胞成分，富含HSP、EGFRvII等多種生物活性分子，在適當(dāng)?shù)臈l件下可持續(xù)發(fā)揮長期穩(wěn)定的免疫調(diào)節(jié)作用，由于其體積小，易保存，穩(wěn)定高效，且為非細(xì)胞性物質(zhì)，集中了DC疫苗和非細(xì)胞載體的優(yōu)勢(shì)，因而有望取代DC成為一種新的免疫治療手段，在非細(xì)胞性疫苗生物治療方面前景廣闊。Exosome富含各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，可以將相應(yīng)的信號(hào)從胞內(nèi)帶到胞外，引起細(xì)胞周圍各種信息的交換。在基礎(chǔ)研究中，發(fā)現(xiàn)exosome含有線粒體及與真核生物有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在解釋線粒體疾病、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及克隆方面起到一定的作用。

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