凌 云 吳紅玲 劉文娟 王 芳 徐明明 毛艷芳

1. 深圳市第六人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣東深圳 518052；2. 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，廣東深圳 518000

KCNE2突變引起6型長QT間期綜合征的機(jī)制探討

凌 云1吳紅玲1劉文娟2王 芳1徐明明1毛艷芳1

1. 深圳市第六人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣東深圳 518052；2. 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，廣東深圳 518000

探討KCNE2突變體通過對(duì)三種Kv通道（IKr、IKs、Ito）功能的影響，造成心肌復(fù)極延遲，APD 延長，引起6型長QT間期綜合征。因?yàn)樾呐K電穩(wěn)定性遭到破壞，容易產(chǎn)生室性心律失常、暈厥甚至猝死。

KCNE2；LQT6；電壓依賴性鉀通道

長QT間期綜合征（long QT syndrome，LQT）是由于心臟復(fù)極化異常引起的心律紊亂性疾病，心電圖表現(xiàn)為QT間期延長、T波異常，易產(chǎn)生室性心律失常、暈厥和猝死。發(fā)生在心臟電壓依賴性鉀離子通道（Kv）α或β亞基的遺傳性突變引起LQT，其中由于KCNE2突變引起的LQT為6型LQT。由于KCNE2對(duì)多種參與心臟動(dòng)作電位形成的電壓依賴性鉀通道（Kv）具有調(diào)節(jié)作用，其在心電穩(wěn)定性中的作用十分復(fù)雜。本資料主要闡述LQT6相關(guān)的KCNE2突變體，包括T8A、Q9E、M54T、I57T、V65M、A116V對(duì)三種Kv通道（心臟快延遲整流鉀通道電流-IKr、心臟慢延遲整流鉀通道電流-IKs、瞬間外向鉀電流-Ito）功能的影響，探討LQT6的發(fā)病機(jī)制。

1 KCNE2與LQT

KCNE家族是一組基因結(jié)構(gòu)上相似，編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)功能相近的一組基因，它們的蛋白產(chǎn)物是編碼人類電壓門控性鉀通道的β亞單位，與相應(yīng)鉀通道的α亞單位相互作用形成穩(wěn)定具有特定功能的復(fù)合體-完整的鉀通道。KCNE2為KCNE家族的一員，由Abbott GW等[1]于1999年將其完整克隆并定位在21q22.1。KCNE2全長732 bp，含有一個(gè)外顯子，編碼區(qū)為74-445區(qū)段。編碼產(chǎn)物為MinK相關(guān)肽1（mink-related peptide 1，MiRP1），MiRP1是一個(gè)含有123個(gè)氨基酸的小分子蛋白，其結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)一致的糖基化位點(diǎn)和兩個(gè)蛋白激酶C介導(dǎo)的磷酸化位點(diǎn)，整個(gè)蛋白分子也只有一個(gè)跨膜區(qū)即49～69區(qū)域。雖然MiRP1 只有一個(gè)跨膜片段，單獨(dú)表達(dá)并不具有通道功能，但它卻作為β亞基對(duì)多種參與心臟動(dòng)作電位（action potential，AP）形成的電壓依賴性鉀通道的α亞基，如HERG（IKr 的α亞基）[1]、Kv4.2 和Kv4.3（Ito的 α 亞基）[2]、KvLQT1（即 KCNQ1，IKs的α亞基）等[3-4]的正常生理功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。

正常心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位由鉀、鈉、鈣和氯離子的跨膜流動(dòng)形成。異常的鈉、鉀、鈣通道導(dǎo)致異常的離子流動(dòng)，可能延緩心室復(fù)極，表現(xiàn)為QT間期延長[5]。KCNE2 是LQT6的致病基因，其突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)的編碼錯(cuò)誤，引起鉀通道的蛋白的亞單位變異，導(dǎo)致心肌細(xì)胞復(fù)極延遲、QT間期延長、細(xì)胞的電穩(wěn)定性降低。發(fā)生在KCNE2 基因上的突變，包括T8A、Q9E、M54T、I57T、V65M、A116V 等[1，6-8]，引起 LQT6，表現(xiàn)為心室 AP 延長，發(fā)生致死性室性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高。

2 KCNE2與IKr

IKr為 HERG類通道電流，HERG蛋白是心臟IKr通道的主要構(gòu)成單位，但在實(shí)驗(yàn)中它不能完全重演機(jī)體自然的IKr通道的功能。而KCNE2的基因產(chǎn)物MiRP1與HERG共同形成的穩(wěn)定復(fù)合物與機(jī)體自然的IKr通道在整體行為、對(duì)細(xì)胞外鉀離子的敏感性、通道的失活速度以及更為重要的對(duì)抗心律失常藥物E-4031的反應(yīng)等諸多方面都完全相同[6]，提示MiRP1對(duì)HERG有明確的調(diào)節(jié)作用。

Isbrandt D等[8]研究發(fā)現(xiàn)，HERG+KCNE2與 HERG+KCNE2-V65M介導(dǎo)的電流在穩(wěn)態(tài)激活方面兩者沒有明顯差異；同樣，兩者在電壓依賴性穩(wěn)態(tài)失活方面也沒有差別。V65M 加快HERG 通道的失活。HERG+KCNE2-V65M通道加速失活的時(shí)間歷程可能會(huì)減少IKr通道在心肌細(xì)胞的電流密度，從而損害心肌細(xì)胞在對(duì)突然的細(xì)胞膜去極化過程（如期外收縮）做出回應(yīng)時(shí)再極化的能力。

Q9E改變了通道的電壓依賴性，即需要更正的電壓值才能激活；M54T加速了通道的失活；I57T和A116V分別影響了離子流的大小和細(xì)胞膜表面通道蛋白分子的生物半衰期。

Lu Y等[9]在中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，KCNE2的三種突變體T8A、Q9E 和M54T 均對(duì)HERG通道的門控動(dòng)力學(xué)有明顯的影響。與HERG+WT-KCNE2或HERG單獨(dú)作用相比，HERG+KCNE2-T8A更負(fù)顯性的穩(wěn)態(tài)激活，HERG+KCNE2-M54T更加正顯性的穩(wěn)態(tài)激活。共同表達(dá)的WT， T8A或Q9E KCNE2與HERG在電壓依賴性穩(wěn)態(tài)失活沒有顯著的改變，而KCNE2-M54T引起一個(gè)小的但是顯著的負(fù)向改變。所有三個(gè)突變體都會(huì)引起IKr通道在去極化電位顯著的失活減慢。KCNE2-T8A加速IKr通道的失活與從失活狀態(tài)恢復(fù)。與HERG單獨(dú)或HERG+WT-KCNE2通道相比，在緊密的成對(duì)早搏期間，T8A和Q9E突變體可引起顯著的巨大電流峰值；在較長的耦合間期，三種突變體均引起較大的電流峰值。

對(duì)早搏刺激反應(yīng)產(chǎn)生的電流峰值被認(rèn)為是通過抑制早搏來保護(hù)心臟免于心律失常[9]。人們或許會(huì)期望HERG峰電流的提高可以增強(qiáng)對(duì)心臟的保護(hù)作用?？墒?，心臟對(duì)早搏刺激的綜合反應(yīng)也會(huì)被其他通道的反應(yīng)所決定，其中最重要的就是鈉通道從電壓門控失活的恢復(fù)。已經(jīng)證明會(huì)引起明顯的“功能獲得”或“功能喪失”的鈉通道功能的輕微變化，均會(huì)顯著提高心律失常的風(fēng)險(xiǎn)。所以，在一個(gè)早搏刺激期間HERG電流峰值的增加，通過抵抗鈉通道的激活而導(dǎo)致的去極化，將引起明顯的鈉通道的“功能喪失”從而促進(jìn)心律失常。

IKr是心肌細(xì)胞2相和3相的主要復(fù)極電流之一，它在動(dòng)作電位坪相起始時(shí)很小，而在動(dòng)作電位2相和3相時(shí)明顯增加，因此Ikr能調(diào)節(jié)動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間?，F(xiàn)已證明，心肌原型 I Kr的固有特征必須有HERG與KCNE2共同表達(dá)。IKr功能增強(qiáng)使K+外流增加，作電位時(shí)程 （APD）縮短。反之，IKr功能減弱，導(dǎo)致心肌動(dòng)作電位平臺(tái)期延長和早期后除極，引起心律失常。由突變的KCNE2與HERG構(gòu)成的IKr通道，表現(xiàn)為激活減慢、失活加快，導(dǎo)致通道開放緩慢，關(guān)閉迅速，使K+外向復(fù)極電流減弱，延長復(fù)極化[10]。

3 KCNE2與IKs

IKs是緩慢延遲整流K+電流，屬KvLQT類通道電流。KvLQT通道在動(dòng)作電位復(fù)極到0 mV左右激活，動(dòng)作電位3相末期失活。IKs電流激活緩慢，含兩個(gè)激活時(shí)間常數(shù)（350 ms和8.5 s），幾乎沒有失活。KCNQ1單獨(dú)表達(dá)產(chǎn)生的電壓依賴性鉀電流，快速激活并且電壓依賴性失活，其電子特征與野生型Iks相差很大。而KCNE1與KCNQ1共同表達(dá)的電流特性與野生型IKs相似?，F(xiàn)普遍認(rèn)為心臟延遲整流鉀電流IKs是由KCNQ1與KCNE1蛋白相互作用形成。

研究發(fā)現(xiàn)，KCNE2，這一一直被認(rèn)為是HERG通道的調(diào)節(jié)亞基對(duì)KCNQ1的門控特征也有顯著的調(diào)節(jié)作用[4]。將KCNE2與KCNQ1共同轉(zhuǎn)染到COS、CHO和HEK-293細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)KCNE2使電壓依賴性KCNQ1電流轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷悍且蕾囆?，并使通道永久開放，產(chǎn)生背景電流。心肌細(xì)胞IKs電流振幅可在細(xì)胞膜上可供利用的KCNE2亞單位的動(dòng)態(tài)控制下而改變[11]，從而可調(diào)控靜息膜電位，影響折返周期及動(dòng)作電位的發(fā)放頻率。而KCNE2突變改變了這一正常的相互作用，導(dǎo)致活化速度減少和電流活化電壓依從改變，產(chǎn)生更多的正電勢(shì)，減少IKs，延長復(fù)極化[10]。

Tinel N等[4]在哺乳動(dòng)物COS細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，KCNE2-Q9E突變體比它的野生型等位基因?qū)CNQ1電流有更顯著的抑制作用。KCNE2-I57T突變體影響KCNQ1電流，表現(xiàn)為：（1）降低KCNQ1電流的激活速率；（2）消除了尾電流復(fù)極化的凸峰；（3）加速去激活過程；（4）改變了電壓依賴性通道向去極化電位的激活。

IKs是心室肌動(dòng)作電位3期電流，它同時(shí)與快速激活的延遲整流型鉀通道IKr形成復(fù)極2期（平臺(tái)期）鈣離子流的反向平衡離子流。KCNQ1的變異使有功能的鉀離子通道數(shù)量明顯減少，功能減弱，鉀離子外流減小，延遲整流鉀電流減小，動(dòng)作電位時(shí)程延長產(chǎn)生早期后除極和觸發(fā)活動(dòng)，心室肌復(fù)極延長，QT間期延長。KCNE2-I57T與Q9E突變體會(huì)通過減少瞬時(shí)的KCNQ1±KCNE2電流而減少KCNQ1通道所攜帶的K+電流，這種影響很可能減少心臟再極化儲(chǔ)備，可導(dǎo)致尖端扭轉(zhuǎn)性室速（TDP）及心室顫動(dòng)。

4 KCNE2與Ito

近來體外研究表明KCNE2 能夠與Kv4.2 結(jié)合調(diào)節(jié)其門控動(dòng)力學(xué)[2]，提示KCNE2不僅是IKr的β亞基， 它可能同樣作為瞬間外向鉀電流（Ito）的β亞基調(diào)節(jié)其功能。在人類心臟，Kv4.3而非Kv4.2是Ito 通道的主要α亞基[12]。劉杰等[13]研究發(fā)現(xiàn)，KCNE2與Kv4.3共表達(dá)后，通道電流密度較Kv4.3減少；通道的激活和失活明顯減慢，電壓依賴性失活發(fā)生正向移位，同時(shí)加快 Kv4.3 通道從失活中的恢復(fù)。提示KCNE2可能作為人類心肌細(xì)胞膜Kv4.3鉀離子通道一個(gè)重要的輔助亞基——β亞基參與Ito通道功能的調(diào)節(jié)。

筆者利用膜片鉗技術(shù)在哺乳細(xì)胞系COS-7研究發(fā)現(xiàn)，I57T與Kv4.3共表達(dá)后，通道的電流密度較KCNE2和Kv4.3共表達(dá)電流密度稍有降低；使電壓依賴性失活曲線更靠近Kv4.3 電壓依賴性失活曲線，甚至有輕微的負(fù)向移位。與WT 相比，I57T減慢Kv4.3從失活中恢復(fù)。V65M則使Kv4.3電流密度顯著降低，使電壓依賴性失活曲線向正方向移位，與WT 相比能進(jìn)一步加快Kv4.3 從失活中恢復(fù)。

Ito在動(dòng)作電位0相激活，參與動(dòng)作電位1相復(fù)極，決定2相動(dòng)作電位的起點(diǎn)水平，并調(diào)節(jié)Ca2+通道及Na+-Ca2+交換的活性，影響動(dòng)作電位時(shí)程（APD）。Ito功能下調(diào)，將使心室 QT 間期延長，造成室性心律失常，甚至心臟猝死[14-15]。本資料的研究發(fā)現(xiàn)，I57T 對(duì)Kv4.3 激活和失活動(dòng)力學(xué)無明顯影響，電壓依賴性失活發(fā)生輕微的負(fù)向移位，I57T 與Kv4.3 共表達(dá)通道從失活中恢復(fù)較Kv4.3+KCNE2通道明顯減慢。V65M 對(duì)Kv4.3門控動(dòng)力學(xué)有明顯的影響，其方向與WT-KCNE2一致，表現(xiàn)為進(jìn)一步減慢Kv4.3激活與失活的速度，引起通道電壓依賴性失活發(fā)生明顯的正向移位，同時(shí)加快通道從失活中恢復(fù)。兩種突變對(duì)Kv4.3通道電流密度、激活、失活門控動(dòng)力學(xué)等綜合作用的結(jié)果可能均是改變Ito電流，破壞心電穩(wěn)定性，引起LQT。

以上各種基因突變所致LQTS 的病理生理學(xué)的共同機(jī)制是造成心肌復(fù)極延遲，APD 延長，心臟電穩(wěn)定性破壞，導(dǎo)致TDP的易患性增加。但迄今APD 延長引起TDP 的電生理機(jī)制尚未完全清楚。早期后除極可能是其始發(fā)機(jī)制之一，反復(fù)觸發(fā)或折返使室性心動(dòng)過速得以維持。如果患者短期內(nèi)室速自發(fā)終止，則臨床表現(xiàn)為暈厥，如果發(fā)作時(shí)間較長，轉(zhuǎn)為室顫，則致猝死[16-17]。

5 結(jié)論

隨著離子通道研究的飛速進(jìn)展，初步了解了心肌細(xì)胞電壓依賴性K+通道的分子基礎(chǔ)。但是現(xiàn)有的發(fā)現(xiàn)并不能闡明KCNE2上的所有突變引起LQT6的機(jī)制，主要原因之一是現(xiàn)有的工作只研究了KCNE2部分突變體的作用，都只是在脫離了心肌細(xì)胞的條件下研究了LQT6相關(guān)突變體對(duì)某一種Kv通道的影響。心肌克隆K+通道在心肌細(xì)胞膜上的表達(dá)呈不純一性，可能數(shù)種不同的K+通道α亞單位和不同的輔助亞單位共同構(gòu)成心肌細(xì)胞膜上某一種K+通道。而這種非純一性表達(dá)也可能在不同部位的心肌細(xì)胞膜上表現(xiàn)出來。因此，全面系統(tǒng)地研究LQT6相關(guān)的所有KCNE2突變體對(duì)在體心肌細(xì)胞離子通道和動(dòng)作電位的影響，對(duì)于闡明LQT6的發(fā)病機(jī)制以及設(shè)計(jì)和篩選有效的治療LQT的藥物具有重要的理論和實(shí)踐意義。

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廣東省深圳市2010年科技計(jì)劃（醫(yī)療衛(wèi)生類） 資助項(xiàng)目（201002169）。

2012-04-25）