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氫氣預(yù)處理對(duì)乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后細(xì)胞活力的影響

2012-01-23 12:45:09
關(guān)鍵詞:復(fù)氧氫氣海馬

盧 欣

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450052

由于缺血再灌注或炎癥引起的氧自由基損傷是導(dǎo)致眾多疾病的原因之一。氫氣作為抗氧化劑可以選擇性地減少細(xì)胞內(nèi)氧自由基,從而起到預(yù)防和治療疾病的作用。氫氣可以選擇性減少羥自由基,特別是活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),從而保護(hù)細(xì)胞。但氫氣并不直接與ROS反應(yīng),通入氫氣可以減輕和抑制氧應(yīng)激造成的損傷程度。由于氫氣可以快速通過(guò)細(xì)胞膜,因此可作為高效的抗氧化劑,減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成來(lái)減少氧損傷從而保護(hù)細(xì)胞[1]。本實(shí)驗(yàn)用MTT法檢測(cè)氫氣預(yù)處理后的海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力,觀察氫氣對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)新生SD乳鼠(<24h),由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma公司),特級(jí)胎牛血清(美國(guó)Sigma公司),胰蛋白酶粉(美國(guó)Sigma公司),NSE染色試劑盒(美國(guó)Sigma公司),MTT試劑(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞:實(shí)驗(yàn)步驟:用75%酒精消毒新生SD乳鼠(<24h)8只,在超凈工作臺(tái)內(nèi)斷頭取出顱腦,放入預(yù)冷的PBS緩沖液中,剝離兩側(cè)海馬,在體視顯微鏡下剔除被膜和血管,剪成0.5mm3大小的組織塊,加入0.25%胰蛋白酶10mL,37℃水浴消化15min,每間隔5min吹打混勻1次。加入等體積含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化3min,加入3倍體積培養(yǎng)基吹打混勻,用2 000目尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度,按2×105/mL接種于6孔培養(yǎng)板和9×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板中,置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔日換液,取第5天細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組:隨機(jī)分為3組,對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng);缺氧/復(fù)氧組(H/R組):細(xì)胞在100%N2中培養(yǎng)15min后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min,造成缺氧/復(fù)氧損傷;氫氣預(yù)處理組:細(xì)胞在2%H2+98%N2中培養(yǎng)15min后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min。

1.2.3 神經(jīng)元鑒定:將處理后6孔板中細(xì)胞用1:1的甲醇:丙酮固定30min,用預(yù)冷的PBS沖洗3遍后,按照進(jìn)行NSE試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行免疫化學(xué)染色,著色陽(yáng)性為棕黃色。

1.2.4 細(xì)胞活力測(cè)定:將處理后96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入MTT(5g/L)20μL和180μL無(wú)血清培養(yǎng)液,孵育4h后終止培養(yǎng)。盡可能吸凈每孔MTT液后,加入100μL二甲基亞砜(DMSO),震蕩10min,在酶聯(lián)儀595nm處測(cè)定吸光值(OD)。細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫化學(xué)染色顯示:對(duì)照組視野布滿棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞,細(xì)胞胞體不規(guī)則,神經(jīng)突觸互相連接成網(wǎng);缺氧/復(fù)氧組棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少,細(xì)胞皺縮,神經(jīng)突觸很少,氫氣預(yù)處理組棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比缺氧/復(fù)氧組多,仍能看到不規(guī)則的胞體形態(tài),仍有連接的神經(jīng)突觸。

細(xì)胞活力測(cè)定顯示:以對(duì)照組海馬神經(jīng)元的細(xì)胞活力100%,缺氧/復(fù)氧組(39.8±2.41)%,氫氣預(yù)處理組(51.0± 1.94)%。與對(duì)照組比較,缺氧/復(fù)氧損傷使細(xì)胞活力大為降低(P<0.05),而氫氣預(yù)處理組的細(xì)胞活力較缺氧/復(fù)氧組明顯升高(P<0.05),說(shuō)明氫氣能夠提高海馬神經(jīng)元細(xì)胞的活力,減少缺氧/復(fù)氧損傷。

3 討論

氫氣是一種雙原子氣體,密度小于空氣,在一些化學(xué)反應(yīng)中有一定的還原性,被認(rèn)為是惰性氣體。Downey等[2]的研究表明,氫氣(hydrogen,H2)可能是除了一氧化碳(carbon monoxide,CO)、硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)和一氧化氮(nitric oxide,NO)的第四類氣體類的信號(hào)分子(gasotransmitter),在某些情況下可以參與機(jī)體的抗氧化過(guò)程[3]。Maier等[4-6]的研究表明,大鼠吸入2%氫氣可顯著減輕腦缺氧/復(fù)氧損傷,說(shuō)明氫氣是一種比較理想的細(xì)胞保護(hù)劑。這是由于氫氣是一種較小的生物活性分子,透過(guò)細(xì)胞膜的速度較快,又易于進(jìn)入線粒體。雖然氫氣不直接和氧自由基反應(yīng),但可作為高效的抗氧化劑,選擇性地減少ROS[7]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞,制造缺氧/復(fù)氧損傷模型,采用免疫化學(xué)鑒定和MTT法初步探討了氫氣對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氫氣預(yù)處理可增加細(xì)胞活力,從而對(duì)離體的海馬神經(jīng)元細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷起到保護(hù)作用。

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[2] 胡文忠,王曉強(qiáng).一氧化氮與一氧化氮合酶抑制劑對(duì)腦缺血后海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2011,14(3):8-9.

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