張敬如，趙 凱，黃復(fù)生，王 昆

（中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病原生物學(xué)教研室，重慶 400038）

納米科學(xué)是目前全球關(guān)注的熱點(diǎn)前沿科技領(lǐng)域，人類的生活已不知不覺(jué)步入了“納米時(shí)代”。當(dāng)前已有數(shù)十種納米材料應(yīng)用于日常生活中，碳納米管可謂其中的佼佼者。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)碳納米管在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，但由于其粒徑小，可在人體主要器官分布沉積，因此其可能產(chǎn)生的生物效應(yīng)與安全性問(wèn)題也逐漸成為關(guān)注的焦點(diǎn)。在此就相關(guān)研究作一綜述。

1 概述

碳納米管（carbon nanotube，CNT）又稱巴基小管，是由日本NEC公司的Iijima于1991年發(fā)現(xiàn)的新型納米材料，是由碳原子形成的石墨片繞中心軸按一定的螺旋角卷曲而成的無(wú)縫、中空的管體。碳納米管結(jié)構(gòu)與球烯和石墨類似，與金剛石、石墨、富勒烯同屬碳的同素異形體，按結(jié)構(gòu)可分為單壁碳納米管（SWCNT）和多壁碳納料管（MWCNT）。單壁碳納米管由單層石墨構(gòu)成，直徑0.4～2 nm，長(zhǎng)度一般可達(dá)數(shù)十微米，甚至長(zhǎng)達(dá)20 cm，具有較好的對(duì)稱性和單一性；多壁碳納米管由多個(gè)同心石墨圓柱體組成，層數(shù)在2～50層之間，層間距為0.34 nm，直徑2～30 nm，長(zhǎng)度為0.1～50μm。它們的抗張強(qiáng)度高，質(zhì)量極輕，熱和化學(xué)穩(wěn)定性很高，并有金屬導(dǎo)體和半導(dǎo)體電學(xué)性質(zhì)。目前碳納米材料全球年產(chǎn)量已達(dá)幾百噸，產(chǎn)品涉及很多領(lǐng)域，這使得研究者、生產(chǎn)者和普通消費(fèi)者都將有更多的機(jī)會(huì)接觸到碳納米管。人們?cè)谏钪锌赡芙佑|到碳納米管，主要來(lái)自含碳材料燃燒產(chǎn)生的煙塵，生產(chǎn)碳納米管時(shí)逸散出的顆粒物，以及在醫(yī)藥領(lǐng)域中以診斷和治療為目的直接注入人體的碳納米管。

2 在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 作為藥物載體

作為納米材料，碳納米管的空腔管體可容納生物特異性分子和藥物，優(yōu)良的細(xì)胞穿透性能使其可作為載體運(yùn)送生物活性分子及藥物進(jìn)入細(xì)胞或組織。原始碳納米管不溶于任何溶劑，而功能化修飾可改善碳納米管的溶解性和生物相容性，作為藥物、疫苗、基因等的運(yùn)送載體，其應(yīng)用與研究日益深入。

熒光標(biāo)記的胺基化碳納米管與人早幼粒白血病細(xì)胞在37℃共培養(yǎng)1h后，應(yīng)用熒光顯微鏡可以觀察到，細(xì)胞表面有較多的熒光聚集，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)也可觀察到熒光，這說(shuō)明碳納米管能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[1]。采用異硫氰酸熒光素（isothiocyanato fluorescein，F(xiàn)ITC）標(biāo)記胺基化碳納米管及肽偶聯(lián)的碳納米管，考察這兩種修飾碳納米管的細(xì)胞穿透能力，發(fā)現(xiàn)它們均可穿透細(xì)胞膜：標(biāo)記的胺基化碳納米管主要分布于細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)入細(xì)胞核較慢；而肽偶聯(lián)的碳納米管可以快速地進(jìn)入細(xì)胞核[2－3]。聚乙二醇修飾的多壁碳納米管能在不損傷質(zhì)膜的情況下進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其在胞內(nèi)的蓄積不僅不影響細(xì)胞增殖和周期，更重要的是對(duì)多重耐藥癌細(xì)胞和敏感細(xì)胞效果相同[4]。將抗腫瘤藥物鹽酸多柔比星裝載于羧基化碳納米管內(nèi)，由于高表面積和氫鍵作用，其吸附能力更強(qiáng)、性能更穩(wěn)定，載藥量和體內(nèi)吸收都較好[5]。Ito等[6]采用碳納米管作為紅細(xì)胞生成素口服制劑載體，發(fā)現(xiàn)短的碳納米管可運(yùn)載更多紅細(xì)胞生成素到靶細(xì)胞，證明細(xì)胞攝取碳納米管有長(zhǎng)度選擇。也有研究表明，不同的修飾碳納米管可穿透不同細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞部位也有可能不同[7]。

2.2 作為新型生物材料

碳納米管具有相當(dāng)高的強(qiáng)度和韌性，不能進(jìn)行生物降解，細(xì)胞可以在其表面生長(zhǎng)繁殖并沉淀新的活性物質(zhì)，再轉(zhuǎn)變成正常的功能性骨組織。原始的碳納米管不能吸附鈣離子，需先將其功能化，才能作為骨組織再生支架。作為一種新型生物材料，碳納米管在骨組織工程方面發(fā)展迅速，它可以單獨(dú)作為支架，也可以與高分子有機(jī)物或無(wú)機(jī)物復(fù)合形成支架，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增長(zhǎng)。

羥基磷灰石是目前國(guó)際上公認(rèn)的硬組織植入材料，但其力學(xué)性能較差，不能用作承重植入體。碳納米管與羥基磷灰石復(fù)合，有望在保持生物相容性的同時(shí)，改善羥基磷灰石脆性大、抗折強(qiáng)度低的不足。Balani等[8]把多壁碳納米管均勻包覆在羥基磷灰石上，包覆后的羥基磷灰石斷裂韌度提升了56％，而結(jié)晶度提升了27％；將磷灰石修飾的多壁碳納米管與人成骨細(xì)胞MG－63共培養(yǎng)，成骨細(xì)胞活力可達(dá)到67.23％，細(xì)胞增殖明顯提高。

2006年，Zanello等[9]率先用碳納米管作支架培養(yǎng)成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞在多壁碳納米管和單壁碳納米管上均有很高的細(xì)胞生長(zhǎng)率。將碳納米管與聚碳酸酯共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)碳纖維可促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附，而降低平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的黏附[10]。Usui等[11]使碳納米管緊鄰骨組織以探究其對(duì)骨的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其幾乎不引起局部炎癥反應(yīng)，并可協(xié)助骨產(chǎn)生。

碳納米管獨(dú)特的電學(xué)性質(zhì)促進(jìn)了其在神經(jīng)應(yīng)用方面的研究。純化的多壁碳納米管能促進(jìn)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的電信號(hào)傳導(dǎo)[12]。用多壁碳納米管包裹傳統(tǒng)的鎢和不銹鋼等金屬電極，碳納米管層對(duì)神經(jīng)電極的記錄和電刺激信號(hào)有增強(qiáng)效果[13]。作為神經(jīng)再生支架，不僅要有導(dǎo)電性，還要能促進(jìn)神經(jīng)元再生。研究表明，碳納米管可促進(jìn)神經(jīng)組織的再生和修復(fù)，減少瘢痕的產(chǎn)生。Mattson等[14]研究發(fā)現(xiàn)，多壁碳納米管能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)，化學(xué)修飾后的功能化碳納米管具有促神經(jīng)再生作用，可與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子共價(jià)鍵結(jié)合，促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)；在多壁碳納米管表面涂一層生物活性分子4－羥基壬烯酸（4－HNE），與未修飾多壁碳納米管比較，神經(jīng)軸突長(zhǎng)度增加近2倍，軸突分支增加近3倍。美國(guó)研究的“納米腳手架”可以引導(dǎo)神經(jīng)祖細(xì)胞選擇性分化為神經(jīng)細(xì)胞，這一成果有望促進(jìn)產(chǎn)生治療中樞系統(tǒng)癱瘓的新方法。碳納米管除具有促神經(jīng)再生作用外，還可減少神經(jīng)組織瘢痕產(chǎn)生。研究者將碳納米纖維與聚氟乙烯的混合物壓縮成平板，用來(lái)培養(yǎng)與瘢痕產(chǎn)生有關(guān)的星細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著碳納米管含量的增加，聚氟乙烯含量的減少，星細(xì)胞的黏附也呈減少趨勢(shì)。

3 毒性作用及其主要機(jī)制

3.1 肺臟毒性

由于碳納米管質(zhì)量輕，可通過(guò)呼吸道途徑進(jìn)入人體，并在肺部沉積，造成肺部肉芽腫、纖維化或炎癥[15]。肺泡巨噬細(xì)胞廣泛分布于肺泡內(nèi)及呼吸道上皮表面，具有吞噬、清除異物和保護(hù)肺的功能，是呼吸道的第一道防線。碳納米管進(jìn)入肺臟后主要是通過(guò)肺泡巨噬細(xì)胞清除。碳納米管被巨噬細(xì)胞吞噬后，更多地沉積在肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)，發(fā)生肉芽腫性炎癥，其損害機(jī)制可能與碳納米管的物理化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，尤其是小尺寸效應(yīng)，使沉積部位較深，更容易滲透進(jìn)入肺深部組織[16]。研究表明，碳納米管尺寸越小，巨噬細(xì)胞越難以快速將其清除，碳納米管的粒徑和數(shù)目與造成的肺部損傷有著密切聯(lián)系。

將單壁碳納米管與炭黑和石英作對(duì)比研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在染毒劑量相同的情況下，單壁碳納米管的毒性超過(guò)碳黑和石英。Lam等[17]將含單壁碳納米管懸浮液通過(guò)氣管滴注方式注入小鼠肺部，同時(shí)以碳黑和石英為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)注入0.5mg碳納米管小鼠均出現(xiàn)嚴(yán)重肺部炎癥。組織病理學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果表明，第7天后，所有顆粒都會(huì)以一定方式進(jìn)入肺泡，有些顆粒甚至在長(zhǎng)達(dá)90 d后仍停留在肺部。碳黑顆粒只引起小鼠肺部輕微炎癥；而單壁碳納米管則引起肺部上皮細(xì)胞肉芽腫形成，其毒性明顯高于對(duì)照組，并且表現(xiàn)出劑量依賴性。

3.2 細(xì)胞毒性

目前對(duì)碳納米管致細(xì)胞毒性作用的機(jī)制尚無(wú)清楚的認(rèn)識(shí)，現(xiàn)階段研究認(rèn)為，這與碳納米管引起的氧化應(yīng)激存在密切關(guān)系。劉穎等[18]研究了多壁碳納米管對(duì)RAW26417巨噬細(xì)胞的毒性，發(fā)現(xiàn)染毒24h后，部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮變形、細(xì)胞間隙變大等形態(tài)學(xué)改變。多壁碳納米管在其與組織細(xì)胞接觸的巨大表面上可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量自由基，發(fā)生氧化損傷，破壞細(xì)胞膜的完整性，滲漏出大量總蛋白（TP）和乳酸脫氫酶（LDH），產(chǎn)生一氧化氮，從而啟動(dòng)氧化應(yīng)激機(jī)制，引起細(xì)胞損傷或凋亡。單壁碳納米管對(duì)PC12細(xì)胞也顯示出較強(qiáng)毒性，可引起細(xì)胞活力下降，抑制細(xì)胞增殖。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)還發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞被阻滯在G2/M期，S期細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡且細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性。其可能機(jī)制是，碳納米管作用細(xì)胞后向線粒體發(fā)生轉(zhuǎn)移，使線粒體結(jié)構(gòu)損傷及膜電位下降，導(dǎo)致細(xì)胞活性氧過(guò)量產(chǎn)生，引起氧化應(yīng)激。過(guò)量的活性氧可以通過(guò)直接破壞細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA，也可通過(guò)影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因調(diào)控間接引起細(xì)胞損傷。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)單壁碳納米管較短單壁碳納米管毒性作用更大[19]。Cui等[20]的研究也與此結(jié)果相似，但細(xì)胞被阻滯在G1期，可能與碳納米管的類型或細(xì)胞株的不同有關(guān)。從碳納米管本身特性來(lái)看，粒徑越小，毒性作用可能越大[21]。顆粒尺寸越小，其表面積體積比就越大，表面原子數(shù)越多，不飽和鍵數(shù)目增多，使其具有很強(qiáng)的吸附能力和很高的化學(xué)活性，從而產(chǎn)生大量的活性氧自由基，干擾細(xì)胞的抗氧化防御機(jī)制，引發(fā)機(jī)體細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的產(chǎn)生。

4 展望

碳納米管具有許多優(yōu)良的物理和化學(xué)性質(zhì)，在納米材料的研究中具有重要地位，近年來(lái)，作為藥物載體和再生材料，在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。然而，碳納米管卻是一把雙刃劍，廣泛應(yīng)用的同時(shí)也對(duì)人們健康和安全帶來(lái)一定的負(fù)面影響。研究認(rèn)為，碳納米管的毒性作用與其粒徑、表面積、制備方法等有關(guān)。相信隨著研究的不斷深入，碳納米管對(duì)人類健康的影響將越來(lái)越小，它在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域的作用將會(huì)逐漸凸顯。

[1]Kam NW，Jessop TC，Wender PA，et al.Nanotube molecular transporters internalization of carbon nanotube－protein conjugates into mammalian cells[J].J Am Chem Soc，2004，126（22）：6 850－6 851.

[2]Bianco A，Kostarelos K，Partidos CD，et al.Biomedical application of functionalised carbon nanotubes[J].Chem Commun，2005，7（5）：571－577.

[3]Pantarotto D，Briand JP，Prato M，et al.Translocation of bioactive peptides across cell membranes by carbon nanotubes[J].Chem Commun，2004，4（1）：16－17.

[4]Cheng JP，Meziani MJ，Sun YP，et al.Poly（ethylene glycol）－conjugated multi－walled carbon nanotubes as an efficient drug carrier for overcoming multidrug resistance[J].Toxicol Appl Pharmacol，2011，250（2）：184－193.

[5]Chen Z，Pierre D，Heh，et al.Adsorption behavior of epirubicinhy-drochloride on carboxylated carbon nanotubes[J].Int J Pharm，2011，405（1－2）：153－161.

[6]Ito Y，Venkatesan N，Hirako N，et al.Effect of fiber length of carbon nanotubes on the absorp tion of erythropoietin from rat small intestine[J].Int J Pharm，2007，337（1－2）：357－360.

[7]Kostarelos K，Lacerda L，Pastorin G，et al.Cellular up take of functionalized carbon nanotubes is independent of functional group and cell type[J].Nature Nanotechnol，2007，2（2）：108－113

[8]Balani K，Anderson R，Laha T，et al.Plasma－sprayed carbon nanotube reinforced hydroxyapatite coatings and their interaction with human osteoblasts in vitro[J].Biomaterials，2007，28（4）：618－624.

[9]Zanello LP，Zhao B，Huh，et al.Bone cell proliferationon carbon nanotubes[J].Nano Lett，2006，6（3）：562－567.

[10]Price RL，Waid MC，Haberstroh KM，et al.Selective bone cell adhesion on formulations containing carbon nanofibers[J].Biomaterials，2003，24（11）：1 877－1 887.

[11]Usui Y，Aoki K，Narita N，et al.Carbon nanotubes withhigh bonetissue compatibility and bone－formation acceleration effects[J].Small，2008，4（2）：240－246.

[12]Lovat V，Pantarotto D，Lagostena L，et al.Carbon nanotube substrates boost neuronal electrical signaling[J].Nano Lett，2005，5（6）：1 107－1 110.

[13]Keefer EW，Botterman BR，Romero MI，et al.Carbon nanotube coating improves neuronal recordings[J].Nat Nanotechnol，2008，3（7）：434－439.

[14]Mattson M，Haddon R，Rao A.Molecular functionalization of carbon nanotubes and use as substrates for neuronal growth[J].J Mol Neurosci，2000，14：175－182.

[15]Shvedova AA，Kisin ER，Murray AR，et al.Increased accumulation of neutrophils and decreased fibrosis in the lung of NADPH oxidasedeficient C57BL/6 mice exposed to carbon nanotubes[J].Toxicol Appl Pharmacol，2008，231（2）：235－240.

[16]Jitendra K，Virendra G，Rakesh KT，et al.Pulmonary toxicity of carbon nanotubes：a systematic report[J]Nanomed：Nanotechnol，Bio Med，2011，7（1）：40－49

[17]Lam CW，James JT，McCluskey R，et al.Pulmonary toxicity of single－wall carbon nanotubes in mice 7 and 90 days after intratracheal instillation[J].Toxicol Sci，2004，77（1）：126－134.

[18]劉 穎，宋偉民，李衛(wèi)華，等.多壁碳納米管致RAW 26417巨噬細(xì)胞毒性與氧化損傷研究[J].衛(wèi)生研究，2008，37（3）：281－284

[19]Wang JY，Sun PP，Bao YM，et al.An Cytotoxicity of single－walled carbon nanotubes on PC12 cells[J].Toxicol in Vitro，2011，25（1）：242－250.

[20]Cui，DX，Tian，F(xiàn)R，Ozkan，CS，et al.Effect of single wall carbonnanotubes onhumanhEK293 cells[J].Toxicol Lett，2005，155（1）：73－85.

[21]Reddy AR，Reddy YN，Krishna DR，et al.Multi wall carbon nanotubes induce oxidative stress and cytotoxicity inhuman embryonic kidney（HEK293）cells[J].Toxicology，2010，272（1－3）：11－16.