沈辰，鄭珩，顧覺奮

高通量篩選（high throughput screening，HTS）又稱大規(guī)模集群式篩選，是由高容量化合物庫、自動(dòng)化操作、高靈敏度檢測(cè)、高特異篩選模型、高效率數(shù)據(jù)處理 5 個(gè)子系統(tǒng)有機(jī)組合而成，是一種新型、高自動(dòng)化、高靈敏度、高通量的發(fā)現(xiàn)新藥的篩選技術(shù)。其理論基礎(chǔ)是反向藥理學(xué)（reverse pharmacology），即基于受體、酶及離子通道等分子、細(xì)胞水平藥物作用靶點(diǎn)，從現(xiàn)有化合物庫中篩選出具有生物活性的先導(dǎo)化合物，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行組織、器官及疾病相關(guān)動(dòng)物模型研究。

利用藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行藥物篩選，已成功地發(fā)現(xiàn)了大批臨床用藥。如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利、依那普利等降血壓藥物，β-腎上腺素受體阻斷劑普萘洛爾、阿替洛爾等，都是利用分子靶點(diǎn)篩選發(fā)現(xiàn)并經(jīng)過進(jìn)一步研究而成為臨床應(yīng)用的藥物。這些研究成果更加強(qiáng)了人們對(duì)高通量藥物篩選的信心。目前，世界上大型制藥企業(yè)都無一例外地將其作為驅(qū)動(dòng)新藥發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)力引擎，紛紛引進(jìn)新藥研發(fā)領(lǐng)域，使高通量篩選的形式和內(nèi)容不斷豐富發(fā)展[1]。近年來，高通量篩選技術(shù)不僅廣泛應(yīng)用于化學(xué)新藥的篩選，同時(shí)在生物催化劑[2]，RNAi[3]，蛋白質(zhì)類藥物[4]等的篩選過程中也有所應(yīng)用。

高通量篩選技術(shù)具有以下幾方面的發(fā)展趨勢(shì)：①采用基于細(xì)胞的分析篩選方法，可直接在活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)化合物，提高篩選的準(zhǔn)確性；②采用精確的檢測(cè)技術(shù)，使之能夠在相同的分析過程中兼顧效率和特異性；③基于功能基因組學(xué)的藥物高通量篩選逐漸受到重視并應(yīng)用；④開始分析和處理工業(yè)中的實(shí)際問題。該系統(tǒng)在后基因組時(shí)代研究和藥物發(fā)現(xiàn)之間架起橋梁，將很快滲入到未來市場(chǎng)中，打破從基因到藥物研發(fā)鏈條中的瓶頸[5]。

1 高通量篩選應(yīng)用于微生物藥物早期發(fā)現(xiàn)中的優(yōu)勢(shì)

高通量篩選技術(shù)主要應(yīng)用于篩選利用組合化學(xué)制備的大規(guī)?；衔飵靃6]，雖然篩選效率大為提高，但得勢(shì)不得力，其獲得新的化學(xué)實(shí)體的數(shù)量并沒有顯著提高，而且隨著新藥標(biāo)準(zhǔn)的提高，新的化學(xué)實(shí)體數(shù)量反而呈下降趨勢(shì)。因此，天然產(chǎn)物作為創(chuàng)新藥物的篩選資源再次受到重視[7]。

相對(duì)于動(dòng)植物代謝產(chǎn)物來講，微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物具有更易開發(fā)利用、不破壞生態(tài)環(huán)境、可通過發(fā)酵大量獲得和易于采用生物技術(shù)等優(yōu)點(diǎn)[8]。目前已有眾多微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物開發(fā)成為藥物?？股刈鳛槠渲械牡湫痛恚谥委煾腥拘约膊?，保障人類健康方面取得了令人矚目的成就。同時(shí)它不僅應(yīng)用于臨床，也可用于農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)，是一類應(yīng)用最廣泛的藥物。隨著生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展，由微生物產(chǎn)生的具有其他生理活性的物質(zhì)也不斷被發(fā)現(xiàn)，如受體拮抗劑和激動(dòng)劑、酶抑制劑和誘導(dǎo)劑、免疫調(diào)節(jié)劑等，更豐富了微生物藥物生理活性的多樣性。

近年來隨著人們對(duì)極端環(huán)境微生物，海洋微生物的探索，發(fā)現(xiàn)了大量未知的微生物物種及微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物。同時(shí)伴隨著生物技術(shù)的發(fā)展，在基因工程、代謝工程、組合生物合成的推動(dòng)下，通過構(gòu)建工程菌株，獲得了大量結(jié)構(gòu)新穎的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，擴(kuò)充著微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量[9]。利用有效的篩選手段對(duì)其進(jìn)行篩選，將極大地促進(jìn)創(chuàng)新型微生物藥物的早期發(fā)現(xiàn)和苗頭化合物的獲得。而傳統(tǒng)的篩選方法由于處理量少，效率低，面對(duì)大批量化合物處理時(shí)，需要消耗更多的人力和物力，已不能適應(yīng)當(dāng)前大規(guī)模微生物代謝產(chǎn)物的篩選要求。高通量篩選技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)篩選方法的不足，能夠快速而高效地在龐大的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物庫中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物。隨著微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物庫的建立和日趨完善，微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的篩選更加方便和快捷，對(duì)我國創(chuàng)新微生物藥物的開發(fā)起到極大的推動(dòng)作用。

2 微生物藥物高通量篩選樣品庫發(fā)展現(xiàn)狀

目前微生物制藥領(lǐng)域中可供高通量篩選的樣品資源庫主要包括微生物菌株庫及微生物發(fā)酵產(chǎn)物提取品庫等。

隨著化學(xué)分離手段的進(jìn)步與發(fā)展，以及我國在藥物研發(fā)經(jīng)費(fèi)投入的加大，在我國開展規(guī)?；⑸锎渭?jí)代謝產(chǎn)物純品庫已經(jīng)成為可能，而且也十分必要，這是創(chuàng)新型微生物藥物快速高效發(fā)現(xiàn)的必然要求。

在我國，科技部自“九五”期間開始資助支持國內(nèi)籌建國家新藥（微生物）篩選實(shí)驗(yàn)室，“十五”、“十一五”期間又以篩選平臺(tái)的形式資助支持微生物藥物高效篩選。十年來，我國微生物藥物的篩選技術(shù)有了長足的進(jìn)步。在藥物篩選微生物資源方面已經(jīng)建立了近 15 萬株的篩選用菌株庫和 20 萬個(gè)微生物發(fā)酵液提取品的樣品庫。高通量微生物藥物篩選模型已達(dá)到 150 種，年篩選量已由“十五”期間的20 萬樣次，發(fā)展到“十一五”期間的 100 萬樣次。通過大量的規(guī)模化的篩選，已經(jīng)獲得一批藥物先導(dǎo)化合物和藥物候選物，有些已經(jīng)進(jìn)入臨床前研究階段。就微生物藥物的篩選規(guī)模和水平來講，我國的創(chuàng)新微生物藥物篩選已達(dá)到國際先進(jìn)水平[8, 10]。

3 高通量篩選在微生物制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用

高通量篩選技術(shù)不僅推動(dòng)了創(chuàng)新型化學(xué)類新藥的研發(fā)進(jìn)程，近年來，在創(chuàng)新型微生物類新藥研發(fā)過程中的應(yīng)用也日趨廣泛。以下主要介紹近年來高通量篩選技術(shù)在微生物制藥領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的兩個(gè)方面——先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)及菌種篩選。

3.1 在微生物來源的先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

3.1.1 針對(duì)微生物代謝產(chǎn)物化合物庫的高通量篩選 針對(duì)微生物代謝產(chǎn)物化合物庫的高通量篩選過程一般為首先構(gòu)建適宜的高通量篩選模型，再利用微量滴定板對(duì)微生物代謝產(chǎn)物庫中的化合物進(jìn)行高通量篩選，通過相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)篩選目標(biāo)化合物，最后對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行活性驗(yàn)證，以獲得可供進(jìn)一步開發(fā)的先導(dǎo)化合物。

正如前文所述，國家新藥（微生物）篩選中心樣品庫的建立和發(fā)展已極大地促進(jìn)了微生物藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)，相關(guān)研究者根據(jù)不同靶點(diǎn)，對(duì)樣品庫中的化合物進(jìn)行篩選，已經(jīng)獲得了大量微生物來源的具有不同生理活性的先導(dǎo)化合物。

在丙型肝炎病毒（HCV）絲氨酸蛋白水解酶抑制劑的高通量篩選過程中，李健蕊等[11]利用基因重組的方法將含有絲氨酸蛋白水解酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá)，結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）成功構(gòu)建了適用于高通量篩選的特異性蛋白酶抑制劑篩選模型。利用此模型，對(duì)樣品庫中的 4000 個(gè)化合物進(jìn)行初步篩選，獲得了 4 個(gè)具有抗丙肝病毒活性的化合物。

在以 FOXP3 為靶點(diǎn)的免疫抑制劑的高通量篩選過程中，巫曄翔等[12]將轉(zhuǎn)錄因子 FOXP3 基因啟動(dòng)子克隆至含有與報(bào)告基因 β-內(nèi)酰胺酶相偶聯(lián)的表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)染至Jurkat 細(xì)胞株中穩(wěn)定表達(dá)，建立了適宜高通量篩選的模型，進(jìn)而對(duì)樣品庫中 2500 余種化合物進(jìn)行篩選，獲得 4 個(gè)具有免疫抑制活性的化合物。

在以 ApoA-1 為靶點(diǎn)的基因表達(dá)上調(diào)劑的高通量篩選過程中，杜郁等[13]構(gòu)建了重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞 HepG2，利用熒光素酶表達(dá)活性的變化為檢測(cè)指標(biāo)，成功構(gòu)建了 ApoA-1 基因表達(dá)上調(diào)劑高通量篩選模型。對(duì)樣品庫中 5000 余種化合物進(jìn)行篩選，獲得4 個(gè)具有治療動(dòng)脈粥樣硬化潛力的活性化合物。

由此可見，以微生物代謝產(chǎn)物化合物庫為對(duì)象的篩選，與組合化學(xué)品庫的高通量篩選雖然篩選對(duì)象不同，但原理與方法基本相同，所以該方法較為成熟、規(guī)范。

3.1.2 針對(duì)微生物發(fā)酵液提取品庫的高通量篩選 微生物代謝產(chǎn)物中含有大量不為人知的新型化合物，在現(xiàn)有的微生物代謝產(chǎn)物化合物庫中不能保證完全收納。同時(shí)，不同類型的微生物代謝產(chǎn)物的藥理活性會(huì)有所側(cè)重，在針對(duì)某一靶點(diǎn)篩選先導(dǎo)化合物時(shí)，選擇特定類型的微生物的代謝產(chǎn)物提取物進(jìn)行篩選，將會(huì)提高效率，事半功倍。所以針對(duì)微生物發(fā)酵液提取品的高通量篩選是十分必要的，是對(duì)微生物天然代謝產(chǎn)物化合物庫高通量篩選的重要補(bǔ)充。

針對(duì)微生物發(fā)酵液提取品庫的高通量篩選過程，通常是將微生物發(fā)酵提取物加入到微量滴定板中，通過相應(yīng)的篩選模型，從大規(guī)模的微生物發(fā)酵液提取物中獲得目標(biāo)陽性樣品——特定菌株發(fā)酵液提取物，進(jìn)而對(duì)特定菌株進(jìn)行放大發(fā)酵、活性產(chǎn)物提取、分離，獲得活性組分后進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和藥理活性測(cè)定，以得到先導(dǎo)化合物。

在 H1N1 神經(jīng)酰胺酶抑制劑的篩選過程中，Lin 等[14]利用基因工程手段將截短型 H1N1 神經(jīng)酰胺酶基因克隆到載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中，獲得了能夠分泌表達(dá)截短型 H1N1 神經(jīng)酰胺酶的重組菌株，構(gòu)建了新型神經(jīng)酰胺酶抑制劑的高通量篩選模型。利用此模型對(duì)20 000 多個(gè)微生物發(fā)酵液提取物進(jìn)行了篩選，獲得 6 種活性提取物。

近年來，隨著海洋微生物，極端環(huán)境微生物的探索與開發(fā)，大量的新型菌株以及獨(dú)特結(jié)構(gòu)的次級(jí)代謝產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，這為創(chuàng)新微生物藥物的研發(fā)開辟了新的思路?？蒲腥藛T通過對(duì)大量的海洋或極端環(huán)境等新分離菌株發(fā)酵提取品進(jìn)行高通量篩選，獲得了更多具有獨(dú)特生理活性的天然產(chǎn)物及其生產(chǎn)菌株。

在鈣調(diào)磷酸激酶抑制劑的篩選過程中，Margassery 等[15]對(duì)海洋微生物發(fā)酵提取品進(jìn)行了高通量篩選。研究者將含有CDRE::lacZ 融合基因的 Pmrk212 質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞中，獲得酵母報(bào)告菌株，以紫外吸收光譜作為檢測(cè)方法，構(gòu)建了鈣調(diào)磷酸激酶抑制劑的高通量篩選模型。然后對(duì) 81 個(gè)海洋海綿動(dòng)物中所分離的微生物發(fā)酵提取物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)菌株的發(fā)酵提取物具有鈣調(diào)磷酸激酶抑制活性，其菌株編號(hào)分別為 SM8、FMK7A、FMK1B。

總之，針對(duì)微生物代謝產(chǎn)物的高通量篩選，可分別以微生物天然代謝產(chǎn)物化合物庫及微生物發(fā)酵提取物為篩選對(duì)象來進(jìn)行，兩者互相滲透，相輔相成，其最終目標(biāo)均為高效率地獲得藥物先導(dǎo)化合物。近年來，高通量篩選技術(shù)在微生物來源的先導(dǎo)化合物早期發(fā)現(xiàn)過程中的應(yīng)用在國內(nèi)蓬勃發(fā)展，并在創(chuàng)新型微生物藥物的開發(fā)過程中發(fā)揮了極大的作用。表 1 總結(jié)了國內(nèi)近年來微生物代謝產(chǎn)物高通量篩選的部分案例。

3.2 在菌株篩選中的應(yīng)用

微生物具有數(shù)量大，種類多，分布廣的特點(diǎn)，絕大部分微生物菌種并未充分開發(fā)，潛力巨大。因此，從大量的微生物菌株中篩選出所期望的目標(biāo)菌株，在微生物藥物發(fā)現(xiàn)的過程中具有重要的意義。

針對(duì)微生物菌株的高通量篩選，其目的是獲得具有某一特定性質(zhì)的菌株，篩選對(duì)象可以是自然界中分離所得的菌株，可以是原始菌株的突變株，也可以是通過生物技術(shù)改造的工程菌株等。在篩選過程中，開發(fā)合適的培養(yǎng)基，對(duì)微生物進(jìn)行適宜微量滴定板的縮小化培養(yǎng)，以便將微生物菌株直接置于微量滴定板中進(jìn)行生長繁殖。利用多種檢測(cè)技術(shù)對(duì)目的產(chǎn)物的濃度或菌株的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，獲得陽性菌株，進(jìn)而通過復(fù)篩，最終獲得目的菌株——某一特定性質(zhì)的菌株。

表 1 國內(nèi)微生物代謝產(chǎn)物高通量篩選案例小結(jié)

表 2 國內(nèi)微生物菌株高通量篩選案例小結(jié)

Gao 等[19]利用高通量篩選方法，從原始菌株 Streptomyces avermitilis 系列突變株中成功篩選出阿維菌素高產(chǎn)菌株，其產(chǎn)量提高 60%。在高通量篩選模型的構(gòu)建過程中，研究者利用固體培養(yǎng)基代替?zhèn)鹘y(tǒng)的液體培養(yǎng)基，從而可在 96 孔微量滴定板中成功培養(yǎng) S.avermitilis 系列突變株。同時(shí)利用245 nm 紫外吸收值檢測(cè)阿維菌素的產(chǎn)量來代替高效液相色譜的檢測(cè)方法，適合于對(duì)微量滴定板的檢測(cè)。利用建立好的高通量篩選模型，對(duì)由原始菌株突變所獲得的 738 株突變株進(jìn)行了高通量篩選。其中在初篩（preliminary screen）過程中采用了高通量篩選技術(shù)。經(jīng)過初篩共獲得 116 株進(jìn)入復(fù)篩階段（second screen），最終證實(shí)有 38 株的產(chǎn)量比原始菌株提高了 10%。

針對(duì)微生物菌株的高通量篩選，是高通量篩選技術(shù)在微生物制藥領(lǐng)域中的一個(gè)獨(dú)特的應(yīng)用，在我國，近年來也涌現(xiàn)出一些相關(guān)的案例（表 2）。

4 小結(jié)

微生物代謝產(chǎn)物因其種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、材料等領(lǐng)域中，是自然界的寶貴財(cái)富，但正是因其龐大的數(shù)量，一般的篩選方法僅能對(duì)少量的代謝產(chǎn)物或菌株進(jìn)行篩選，這便大大限制了人類對(duì)于微生物天然代謝產(chǎn)物的開發(fā)利用。高通量篩選作為 20 世紀(jì) 80 年代興起的方法，如今已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化合物篩選中。近幾年，高通量篩選新技術(shù)的發(fā)展也大大提高了篩選效率，推動(dòng)了一大批化合物進(jìn)入臨床研究。在微生物制藥領(lǐng)域中高通量篩選也逐漸滲入并發(fā)揮了積極的作用，但還存在一些問題：第一，高通量篩選主要關(guān)注于小分子化合物庫的篩選，而在微生物代謝產(chǎn)物中的篩選涉足較少；第二，專門的微生物代謝產(chǎn)物庫并未系統(tǒng)化建立；第三，新的作用靶點(diǎn)和微量分析方法還需要進(jìn)一步探索?？傊咄亢Y選作為新興的篩選手段，與現(xiàn)代藥物篩選技術(shù)結(jié)合并應(yīng)用于微生物代謝產(chǎn)物的篩選過程中，將會(huì)極大地推動(dòng)微生物制藥的發(fā)展。

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