蒲江 陶立峰 鄧海清 王德海

據(jù)WHO統(tǒng)計，2010年，全球約有140萬人死于肺結(jié)核，880萬罹患結(jié)核病，結(jié)核病已成為當(dāng)今世界第二大傳染性疾病［1－2］。我國是全球22個結(jié)核病流行最嚴(yán)重的國家之一，同時也是全球27個耐多藥結(jié)核病流行最嚴(yán)重的國家之一。據(jù)2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查的數(shù)據(jù)，全國15歲及以上人群活動性肺結(jié)核的患病率為459/10萬［3］，因此早期發(fā)現(xiàn)和診斷出高危人群，有效控制傳染源，是結(jié)核病疫情控制的關(guān)鍵。

近幾年，對早期分泌性抗原性靶蛋白（ESAT6）和早期培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP10）抗原作為結(jié)核診斷的皮試試劑的研究較多，顯示出很好的安全性及較好的診斷特異度和敏感度［4－11］。本研究以重組結(jié)核分枝桿菌ESAT6－CFP10蛋白作為抗原，對不同分枝桿菌菌種致敏的豚鼠進(jìn)行皮試反應(yīng)研究。

材料和方法

一、材料

1.動物：選取90只健康并未做過任何試驗的SPF級（無特定病原體級）白色雌性豚鼠（Hartley品系），體質(zhì)量300～400 g（一般體質(zhì)量滿足即可采用），周齡為15～20周。由中國食品藥品檢定研究院實驗動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2009－0017。

2.菌種：常見環(huán)境分枝桿菌組包括鳥分枝桿菌（CMCCB 95001）、胞內(nèi)分枝桿菌（CMCCB 95002）、蟾蜍分枝桿菌（CMCCB 95003）、堪薩斯分枝桿菌（CMCCB 95013）、海分枝桿菌（CMCCB 95014）、瘰癘分枝桿菌（CMCCB 95017）、戈登分枝桿菌（CMCCB 95018）、蘇加分枝桿菌（CMCCB 95019）、龜分枝桿菌膿腫亞種（CMCCB 95021）（簡稱“龜膿分枝桿菌”）、偶發(fā)分枝桿菌（CMCCB 95022）、草分枝桿菌（CMCCB 95024）、微黃分枝桿菌（CMCCB 95030）；臨床常見致病分枝桿菌組包括非洲分枝桿菌（CMCCB 95049）、牛分枝桿菌（CMCCB 95055）、結(jié)核分枝桿菌（CMCCB 95052，CMCCB 93020，CMCCB 93009）；菌株由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心提供?？ń榫ㄒ呙缰辏┯芍袊称匪幤窓z定研究院提供。

3.主要試劑：結(jié)核菌素純蛋白衍生物（purified protein derivative of tuberculin，TB－PPD），50 IU/ml，批號為20101105，液體制劑，由中國食品藥品檢定研究院提供；胞內(nèi)分枝桿菌純蛋白衍生物（PPD of Mycobacterium intracellulare，PPD－B），0.4 mg/支，由中國食品藥品檢定研究院提供；重組結(jié)核分枝桿菌ESAT6－CFP10蛋白，每支250μg/0.5 ml，液體制劑，批號為 M20101202，由安徽龍科馬生物制藥有限責(zé)任公司提供。

二、方法

1.菌液制備：取卡介菌凍干菌種（60 mg/支），以1 ml生理鹽水溶解后制成濃度為60 mg/ml的菌液。將其余15種新鮮培養(yǎng)的分枝桿菌配制成10 mg/ml菌液（活菌含量約為1×108CFU/ml），臨用前再以生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋。

2.動物篩選（皮試）：將豚鼠左背側(cè)局部去毛，皮內(nèi)注射0.2 ml TB－PPD，于注射后24、48 h觀察局部硬結(jié)的縱徑與橫徑，根據(jù)48 h的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判定，平均硬結(jié)反應(yīng)直徑（縱徑與橫徑相加除以2）小于5 mm判為陰性［12］。90只豚鼠全部皮試陰性，留做實驗。共分為18組實驗，每組使用5只豚鼠。

3.致敏動物：于豚鼠腹股溝皮下注射制備的菌液［13］，每種菌液致敏5只豚鼠（皮試48 h后，如果皮試陰性，即可開始致敏）?？ń榫ㄒ呙缰辏┗罹旅艚M豚鼠和結(jié)核分枝桿菌死菌致敏組豚鼠各注射0.2 ml/只，飼養(yǎng)于清潔級動物房；其他分枝桿菌活菌菌液致敏組豚鼠注射0.5 ml/只，飼養(yǎng)于負(fù)壓動物房的負(fù)壓動物籠具中。

4.重組結(jié)核分枝桿菌ESAT6－CFP10蛋白的制備：采用基因工程手段構(gòu)建ESAT6－CFP10融合蛋白表達(dá)載體，篩選陽性菌落并測序正確，建立生產(chǎn)用種子批系統(tǒng)［14］。將工作種子通過復(fù)蘇、傳代后發(fā)酵，最終通過純化獲得重組結(jié)核桿菌ESAT6－CFP10目的蛋白。

5.致敏動物皮試：在致敏動物3～4周后，將豚鼠背部脊柱兩側(cè)去毛，以輪圈法［15］分別于豚鼠皮內(nèi)注射1μg/ml和5μg/ml的ESAT6－CFP10蛋白、1μg/ml和5μg/ml的PPD－B、TB－PPD（50 IU/ml）各0.1 ml。于注射后24、48 h觀察局部硬結(jié)的縱徑與橫徑，根據(jù)48 h的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判定，平均硬結(jié)反應(yīng)直徑≥5 mm判為陽性［16］。

結(jié) 果

一、臨床常見致病分枝桿菌致敏豚鼠的皮試反應(yīng)結(jié)果

皮試反應(yīng)顯示，TB－PPD、ESAT6－CFP10蛋白以及PPD－B對結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、卡介菌（疫苗株）和非洲分枝桿菌活菌致敏豚鼠的皮試反應(yīng)均呈陽性，而ESAT6－CFP10蛋白對卡介菌（疫苗株）、結(jié)核分枝桿菌死菌致敏豚鼠的皮試反應(yīng)呈陰性（圖1）。硬結(jié)直徑統(tǒng)計及陽性比例見表1。

二、常見環(huán)境分枝桿菌組致敏豚鼠的皮試反應(yīng)結(jié)果

PPD－B對鳥、胞內(nèi)、蟾蜍、堪薩斯、海、瘰癘、戈登、蘇加、龜膿、偶發(fā)、草、微黃分枝桿菌這12種常見環(huán)境分枝桿菌致敏豚鼠的皮試反應(yīng)均呈陽性，而ESAT6－CFP10蛋白以及TB－PPD對上述分枝桿菌致敏豚鼠的皮試反應(yīng)均呈陰性，48 h的皮試硬結(jié)直徑與陽性比例結(jié)果見表2。

討 論

圖1 致敏豚鼠皮試硬結(jié)狀況

表1 臨床常見致病分枝桿菌組致敏豚鼠致敏后48 h的皮試平均硬結(jié)直徑及陽性比例

表2 常見環(huán)境分枝桿菌致敏組豚鼠48 h皮試平均硬結(jié)直徑及陽性比例

多年來，結(jié)核菌素皮膚試驗（tuberculin skin testing，TST）一直是篩選結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和結(jié)核病輔助診斷的重要方法。但TST所用PPD所包含的抗原為常見致病性分枝桿菌（結(jié)核、牛和非洲分枝桿菌）、環(huán)境中的分枝桿菌（鳥、胞內(nèi)、蟾蜍、堪薩斯、海、瘰癘、戈登、蘇加、龜膿、偶發(fā)、草、微黃等分枝桿菌）及BCG所共有，診斷特異度較差，不能區(qū)分BCG接種、非致病性分枝桿菌感染和結(jié)核分枝桿菌感染，更不能鑒別結(jié)核分枝桿菌感染者體內(nèi)有無存活的結(jié)核分枝桿菌；而卡介苗在世界范圍內(nèi)廣泛接種會干擾TST的檢測，減少其診斷效果。對于某些嚴(yán)重結(jié)核病、血行散播性肺結(jié)核或HIV感染者等免疫力低下者，TST診斷的敏感度也不理想。因此，尋找既能區(qū)別卡介苗接種還是結(jié)核分枝桿菌感染、結(jié)核分枝桿菌感染者體內(nèi)有無活菌又敏感度高的診斷方法非常重要。

Maheiras等［17］確定了結(jié)核分枝桿菌基因的差別區(qū)（regions of difference，RD），其中最為重要的RD1區(qū)基因為結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌有毒株所特有，而BCG和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌缺失。ESAT6是RD1區(qū)發(fā)現(xiàn)較早的重要分泌型蛋白，由Rv3875基因編碼，全長285個堿基對，編碼95個氨基酸。1998年Berthet等［18］在研究ESAT6基因表達(dá)調(diào)控機制時，發(fā)現(xiàn)了Lhp基因。Lhp基因即Rv3874基因，位于ESAT6基因上游34 bp處，和ESAT6基因處于同一操縱單元。此基因編碼100個氨基酸，又由于其基因產(chǎn)物在早期培養(yǎng)濾液中出現(xiàn)，因此命名為培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP 10）。ESAT6基因和CFP10基因處于同一操縱子中，一起進(jìn)行協(xié)同轉(zhuǎn)錄。基因產(chǎn)物均為分泌性蛋白，存在于結(jié)核分枝桿菌的早期培養(yǎng)濾液中。

ESAT6蛋白和CFP10蛋白作為結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原，兩者具有大致相同的菌間分布特性。根據(jù)Swissprot和Genbank數(shù)據(jù)庫資料分析，ESAT6基因和CFP10基因嚴(yán)格限制于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和4種非典型分枝桿菌（堪薩斯、海、微黃和蘇加分枝桿菌）中，BCG和大部分非結(jié)核分枝桿菌缺失［16，19－20］。雖然研究兩基因菌間分布特性所用到的菌株不完全相同，但實驗結(jié)果足以說明CFP10和ESAT6基因具有大致相同的菌間分布，即兩基因嚴(yán)格限制于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，BCG和大部分的非結(jié)核分枝桿菌缺失。

目前國內(nèi)外研究較多的是將CFP10和ESAT6蛋白作為刺激原，應(yīng)用體外酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）或酶聯(lián)免疫斑點法（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT）技術(shù)診斷結(jié)核病。Ravn等［21］的一項研究結(jié)果顯示：在39名無結(jié)核分枝桿菌暴露史的BCG接種健康人中，PPD－ELISA 的陽性率為100%，而CFP10－ESAT6－ELISA 陽性僅有1例，具有良好的診斷特異度。對痰菌陰性結(jié)核患者用ESAT6和CFP10抗原進(jìn)行體外診斷，87%的患者能夠被發(fā)現(xiàn)，敏感度較好。

近幾年，以ESAT6為抗原作為結(jié)核診斷的皮試試劑研究也較多。國內(nèi)張靈霞等［4］報道將ESAT6作為皮膚反應(yīng)試劑用于結(jié)核病診斷，發(fā)現(xiàn)ESAT6皮試可以很好地區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染和BCG致敏的動物。國內(nèi)徐苗等［5］對ESAT6基因進(jìn)行改構(gòu)得到重組11 k Da蛋白，在動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，重組結(jié)核分枝桿菌11 k Da蛋白對結(jié)核分枝桿菌活菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌致敏豚鼠的皮膚試驗為陽性，而對滅活結(jié)核分枝桿菌、卡介菌和其他非結(jié)核分枝桿菌致敏豚鼠的皮膚試驗均為陰性。Aggerbeck等［6］研究發(fā)現(xiàn)重組ESAT6蛋白在豚鼠、小鼠和狗等動物上均有較好的安全性，皮試濃度從1μg到1000μg僅有個別輕微不良反應(yīng)出現(xiàn)。目前，ESAT6蛋白作為皮試試劑已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床，國外Arend等［7］隨機雙盲臨床實驗顯示，ESAT6有很好的臨床安全性和生物活性。國內(nèi) Wu等［8］報道在小部分志愿者中進(jìn)行ESAT－6蛋白皮試，結(jié)果顯示ESAT－6蛋白僅誘導(dǎo)結(jié)核患者陽性反應(yīng)，BCG接種健康者為陰性反應(yīng)。

目前以CFP－10蛋白作為皮試試劑，僅在動物實驗見到相關(guān)報道，尚無臨床試驗數(shù)據(jù)。國外Van Pinxteren等［9］研究發(fā)現(xiàn)CFP10和ESAT6兩種蛋白，均能很好的誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌致敏豚鼠的皮試呈陽性反應(yīng)。而在BCG和鳥分枝桿菌致敏豚鼠中，兩種蛋白皮試結(jié)果陰性或僅有個別陽性，敏感度和特異度均好于PPD，但CFP10蛋白的特異度低于ESAT6蛋白。同時IFN－γ體外刺激試驗結(jié)果顯示兩種蛋白聯(lián)用的敏感度和特異度均高于單一蛋白［9］。Weldingh等［10］的實驗結(jié)果也顯示兩種蛋白聯(lián)用的敏感度與PPD相近，較單一抗原敏感度高。

本研究利用基因工程技術(shù)融合表達(dá)CFP10－ESAT6蛋白，該蛋白僅對活結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和非洲分枝桿菌致敏動物呈陽性反應(yīng)，對卡介菌接種或死結(jié)核分枝桿菌及常見環(huán)境分枝桿菌致敏動物均呈陰性反應(yīng)，提示CFP10－ESAT6蛋白如果作為皮試試劑能夠鑒別BCG接種和結(jié)核分枝桿菌感染，可為結(jié)核病的輔助診斷提供強有力的支持。如能應(yīng)用于臨床，將對結(jié)核病的診斷及傳播控制有著非常重要的意義。但是由于本研究實驗組數(shù)較多，工作量比較大，再加上課題時間的限制，每組實驗只采用了5只豚鼠，統(tǒng)計學(xué)上可能存在一定的誤差，這也是今后進(jìn)一步深入研究所需要改進(jìn)之處。

由于中國屬于結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，可為臨床研究規(guī)模和內(nèi)容提供良好空間，如果上述動物實驗的數(shù)據(jù)能在人體得到驗證，該結(jié)果將為臨床上結(jié)核病的早期診斷和鑒別診斷提供重要的依據(jù)，為結(jié)核病的控制節(jié)省大量的資源。

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