金海霞 付雷 王彬 鄭梅琴 陸宇

20世紀(jì)60年代，國外文獻報道了鏈霉素依賴的Mtb菌株，即菌株在含鏈霉素的培養(yǎng)基上生長較在不含藥培養(yǎng)基上旺盛［1－2］。之后，又發(fā)現(xiàn)了“依賴RFP的 Mtb菌株”［3－4］。目前，除 RFP依賴 Mtb菌株外，還報道了 Mtb的INH、S、EMB依賴現(xiàn)象［5－8］。RFP自1971年發(fā)明以來，一直是治療結(jié)核病的首選藥物。資料顯示，Mtb對RFP的依賴率最高。現(xiàn)階段，無論在臨床還是在實驗室研究層面，Mtb藥物依賴現(xiàn)象都還沒有引起足夠的重視。國內(nèi)關(guān)于Mtb藥物依賴現(xiàn)象的研究，大多數(shù)還僅停留于菌株的體外篩選，以及對該現(xiàn)象的簡單描述。國外自20世紀(jì)50年代報道了鏈霉素的依賴現(xiàn)象后，尚未見新的報道。一些研究者利用豚鼠模型在體內(nèi)觀察RFP依賴菌株的依賴現(xiàn)象，但未觀察到依賴菌株與非依賴菌株的差異［9］。有學(xué)者認(rèn)為，依賴是在耐藥基礎(chǔ)上產(chǎn)生的，是量變到質(zhì)變的過程，可能是耐藥菌耐藥基因進一步變異的結(jié)果［10］。目前研究表明，大多數(shù)RFP耐藥是由于其靶分子RNA聚合酶β亞基（RpoB）的編碼基因（rpoB）發(fā)生突變，阻止 mRNA合成所致［11－12］。目前，國內(nèi)外已報道有 70 多個rpoB 基因突變位點［11－14］，95%以上集 中 在 一個被稱為RFP耐藥決定區(qū)的高度保守區(qū)內(nèi)（507～533位），其中又以531、526和516位3個位點的突變最常見，約占所有耐 RFP Mtb基因突變位點的86%［11－12］。本研究以RFP依賴現(xiàn)象為例，擬從體內(nèi)外同時驗證RFP依賴菌株的依賴現(xiàn)象。并通過rpoB基因突變位點分析，比較RFP依賴與耐藥菌株的差異，從而探討依賴菌株的產(chǎn)生原因，為RFP依賴結(jié)核病的診斷和防治提供依據(jù)。

材料和方法

一、材料

1.菌株：Mtb H37Rv（ATCC27294）為本室保存，46例臨床分離菌株均來自國家結(jié)核病參比實驗室，并在本室保存。

2.實驗動物：6～8周齡雄性 SPF（specific pathogen free）級BALB/c小鼠，體質(zhì)量為16～18 g，購自首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。經(jīng)本所動物倫理委員會批準(zhǔn)，開展動物實驗。

3.試劑和培養(yǎng)基：7H9培養(yǎng)基（美國Difico公司）4.7 g溶于900 ml蒸餾水中，加入2.0 ml甘油，121℃高壓10 min，待使用前加入0.1體積分?jǐn)?shù)的營養(yǎng)添加劑白蛋白－葡萄糖－過氧化氫酶（ADC）；7H11培養(yǎng)基（美國Difco公司）21 g，溶于900 ml蒸餾水中，加入5 ml甘油，121℃高壓10 min，加入100 ml OADC（oleate－albumin－dextrose－catalase），冷卻至50～55℃后分裝。含RFP（終濃度為1μg/ml和10μg/ml）的7H11培養(yǎng)基：稱取7H11培養(yǎng)基21 g，溶于850 ml蒸餾水中，加入5 ml甘油，121℃高壓10 min，加入100 ml OADC，同時加入50 ml 20μg/ml或200μg/ml的無菌 RFP溶液，冷卻至50～55℃后分裝。RFP，Rfb均購自Sigma公司。

二、方法

1.菌株的耐藥情況：46例菌株在改良羅氏培養(yǎng)基上通過絕對濃度法測定其對INH、RFP、EMB、S、Km、卷曲霉素（capreomycin，Cm）、Ofx、左氧氟沙星（levofloxacin，Lfx）（以上藥品均購自Sigma公司）的耐藥情況。具體操作過程參見《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》［15］。耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug resistant tuberculosis，MDR－TB）為結(jié)核病患者感染的Mtb在體外被證實至少同時對INH和RFP耐藥；廣泛耐藥結(jié)核?。╡xtensively drug－resistant tuberculosis，XDR－TB）為結(jié)核病患者感染的Mtb在體外被證實除對INH和RFP耐藥外，還對任意一種氟喹諾酮類藥物及對三種二線抗結(jié)核藥物注射劑（Km和 Am、Cm）中的至少一種耐藥［16］。

2.依賴菌株的篩選：46例菌株以1×104CFU/平皿的菌量分別接種于含0、1和10μg/ml RFP的7H11培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，3周后觀察菌株在含藥培養(yǎng)基上的生長是否較不含藥培養(yǎng)基旺盛。根據(jù)《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》，菌落生長占接種面積的1/4、1/2、3/4或布滿接種面積時，分別記為＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋。菌株在含1μg/ml RFP的培養(yǎng)基上的生長多于在不含藥培養(yǎng)基和含10μg/ml RFP的培養(yǎng)基上的生長，且多出＋以上時，判斷為低濃度依賴；菌株在含10μg/ml RFP的培養(yǎng)基上的生長多于在不含藥培養(yǎng)基和含1μg/ml RFP的培養(yǎng)基上的生長，且多出＋以上時，判斷為高濃度依賴；若菌株在含1μg/ml和10μg/ml RFP的培養(yǎng)基上的生長類似，但多于在不含藥培養(yǎng)基上的生長，且多出＋以上時，亦判斷為高濃度依賴；其余情況，判斷為非依賴。

3.小鼠體內(nèi)實驗：選取在體外具有典型的RFP依賴現(xiàn)象的05116菌株，在7 H9液體培養(yǎng)基（含0.05%吐溫80）中生長至對數(shù)生長期后，用PBS（含0.05%吐溫80）制成5×107CFU/ml的菌液。取10 ml置于霧化器中，用氣溶膠感染暴露裝置感染小鼠。同時取0.1 ml的感染菌液用PBS進行10倍系列稀釋后，取0.1 ml接種于7 H11培養(yǎng)基上進行活菌計數(shù)。感染2周后開始灌胃給藥，每周給藥5次，每只小鼠給予0.2 ml。每周記錄體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。小鼠按照給藥的種類和給藥單位劑量分成對照組0.5%羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose sodium，CMC）、10 mg/kg Rfb（Rfb10）組、10 mg/kg RFP（RFP10）組、20 mg/kg RFP（RFP20）組，每組各10只。在感染后第2天、治療開始時分別解剖3只小鼠，取肺進行活菌計數(shù)，作為基線值。在給藥后4周、給藥后8周，每組各解剖5只小鼠，對肺進行攝影、活菌計數(shù)，同時分別接種于不含RFP、含1、10μg/ml RFP的7 H11培養(yǎng)基上，觀察菌株的生長情況。

4.檢測rpoB基因突變位點：選取利福平依賴與非依賴菌株中MDR及XDR菌株共19株，應(yīng)用煮沸法提取基因組DNA。挑取少量菌落置于EP（eppendorf）管中，加入100μl TE緩沖液，混勻，煮沸15 min，立即置于冰上5 min，12 000轉(zhuǎn)/min（離心半徑8 cm）離心3 min，取上清液，－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。PCR擴增：上游引物序列5′－TCAGACCACGATGACCGTTCC－3′，下 游 引 物 序 列 5′－GTCCATGTAGTCCACCTCAGACG－3′。PCR 反應(yīng)采用50μl反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液5μl，MgCl23 μl，d NTPs（10 mmol/L）1 μl，引 物（10μmol/L）各1μl，DNA模板2μl，TaqDNA 多聚酶（5 U/L）1μl，用高壓滅菌后的雙蒸水補至50μl。94℃預(yù)變性5 min，94℃變性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)后，取5μl產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線下鑒定有無擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物片段長688 bp，送華大基因測序以檢測突變位點。

結(jié) 果

1.體外篩選RFP依賴的Mtb菌株：本研究從46例RFP耐藥的Mtb臨床分離株中篩選到18例RFP耐藥伴依賴的菌株（39.1%）和28例RFP耐藥非依賴的菌株（60.9%）（表1）。18例RFP耐藥依賴的菌株中，2例為低濃度依賴菌株，16例高濃度依賴菌株。藥敏結(jié)果顯示，46例菌株具有不同的耐藥組合（表1），MDR、XDR分別占14.3%，67.9%；而RFP耐藥伴依賴株中，MDR、XDR分別占38.89%，55.56%。

圖1 057、05116菌株在體外具有典型的RFP依賴現(xiàn)象：菌株在含10μg/ml RFP的培養(yǎng)基上的生長比在不含藥培養(yǎng)基和含1μg/ml RFP的培養(yǎng)基上的生長至少多出＋。1：不含RFP培養(yǎng)基；2：含1μg/ml RFP培養(yǎng)基；3：含10μg/ml RFP培養(yǎng)基

2.體內(nèi)驗證RFP依賴現(xiàn)象：057、05116菌株在體外具有典型的RFP依賴現(xiàn)象（圖1）。菌株與含10μg/ml RFP的培養(yǎng)基上的生長比在不含藥培養(yǎng)基和含1μg/ml RFP的培養(yǎng)基上的生長至少多出＋。體外藥敏實驗表明05116菌株為INH低度耐藥，RFP高度耐藥，對其他所有受試藥物均敏感。體外依賴實驗表明05116菌株為RFP高濃度依賴。選取05116菌株在小鼠體內(nèi)驗證其RFP依賴現(xiàn)象。給藥期間，各組小鼠體質(zhì)量差異不大（圖2）。給藥后4周、給藥后8周，各組小鼠全肺發(fā)生肉芽腫樣病理改變（圖3，4），但從病理改變和給藥后4周的活菌計數(shù)結(jié)果中未觀察到明顯的藥物依賴現(xiàn)象（表2）。繼續(xù)給藥至8周，各組小鼠的活菌計數(shù)結(jié)果（lgCFU 為6.20～6.60）接近于最初感染的菌量（lgCFU為5.93），并且各組小鼠的活菌計數(shù)結(jié)果從高到低依次為：RFP20組、RFP10組、Rfb10組、對照組，說明，RFP及Rfb對小鼠持續(xù)給藥達8周時，藥物對體外RFP依賴的菌株具有一定的促生長作用，并具有濃度依賴性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（與對照組相比，各組P值均大于0.05）。同時，在給藥后8周，各組小鼠全肺勻漿液在含1μg/ml和10μg/ml RFP的7H11培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果也顯示，菌株仍保持明顯的RFP依賴現(xiàn)象（圖5）。

表1 RFP耐藥株中依賴菌株和非依賴菌株數(shù)（株）

表2 給藥后各組小鼠肺CFU計數(shù)

A列：0μg/mlRFP7H11培養(yǎng)基；B列：1μg/ml7H11培養(yǎng)基；C列：10μg/mlRFP 7H11；在給藥后8周，各組小鼠全肺勻漿液在含1μg/ml和10μg/ml RFP的7H11培養(yǎng)基上菌株仍保持明顯的RFP依賴現(xiàn)象，對照組菌落較少，而其他組則菌落生長相對旺盛圖5 給藥后8周，對照組、Rfb10組、RFP10組、RFP20組小鼠肺部活菌在含0μg/ml、1μg/ml和10μg/ml RFP的7H11培養(yǎng)基上的生長情況

3.rpoB基因突變位點：RFP依賴與非依賴菌株中MDR及XDR菌株共19株，對其rpoB基因進行測序，結(jié)果顯示，8例RFP耐藥非依賴的菌株中，rpoB基因526位發(fā)生突變的菌株占3/8，531位發(fā)生突變的菌株占2/8，533位、522位發(fā)生突變以及561位和672位同時發(fā)生突變的菌株各占1/8；11例RFP耐藥伴依賴的菌株中，rpoB基因526位發(fā)生突變的菌株占4/11，531位發(fā)生突變的菌株占6/11，511位和518位同時發(fā)生突變的菌株占1/11。

討 論

目前國際尚沒有藥物依賴菌的判斷標(biāo)準(zhǔn)。Mtb依賴菌100%為耐藥菌?，F(xiàn)有資料顯示，在我國耐藥結(jié)核患者中，RFP依賴菌的檢出率為14.13%～17.7%，鏈霉素依賴菌的檢出率為7.8%～11.41%，異煙肼依賴菌的檢出率為1.0%～6.52%［4，7］。這說明，在耐藥結(jié)核患者中，藥物依賴菌患者占了很大的比例。本研究中，RFP依賴菌的檢出率為39.1%，高于文獻報道的值，其原因一方面與樣本量有關(guān)，另一方面可能與本單位為三級甲等結(jié)核病專科醫(yī)院，接收的多為病情重、耐多藥、治療效果差的重癥患者有關(guān)。

如圖1所示，臨床分離菌株在體外具有典型的RFP依賴現(xiàn)象。在本研究中，筆者在小鼠氣溶膠感染模型中也觀察到給藥8周時體外RFP依賴菌株05116對RFP及Rfb的依賴現(xiàn)象：給予RFP及利福類藥物治療依賴性菌株感染的小鼠時，小鼠的肺活菌計數(shù)不僅沒有降低，反而呈現(xiàn)濃度依賴性增加。同時，將體內(nèi)傳代后的05116菌株重新接種于含不同RFP濃度的7 H11培養(yǎng)基上，菌株仍表現(xiàn)出明顯的RFP依賴現(xiàn)象。這些結(jié)果間接說明，患者感染藥物依賴性Mtb后，繼續(xù)使用該藥不但治療無效，而且在一定條件下可能促進病原菌生長繁殖，使病情加重。Mtb耐藥造成臨床用藥無效，Mtb藥物依賴無疑將導(dǎo)致臨床有害用藥。這一現(xiàn)象也得到了多位臨床醫(yī)生的觀察證實：部分結(jié)核患者在用藥后，病情惡化；停止用藥，病情反而有所緩解。同時，已經(jīng)有文獻報道表明結(jié)核患者中存在明顯的RFP依賴現(xiàn)象［17］，該患者停用RFP而其他治療藥物不變后，病情明顯好轉(zhuǎn)并治愈。RFP依賴菌株05116在小鼠體內(nèi)也表現(xiàn)出對Rfb的依賴性，這也間接證明Rfb和RFP存在交叉耐藥，從而提醒臨床醫(yī)生為RFP耐藥的患者選擇利福類藥物時需慎重考慮。從小鼠給藥4周、8周的肺部病理改變中未觀察到明顯的藥物依賴現(xiàn)象，筆者推測其原因之一可能是本研究在氣溶膠感染小鼠的過程中，感染菌量偏大，從而無法通過肉眼觀察分辨出RFP或Rfb的促生長作用（圖3，4）。

有人認(rèn)為，依賴是在耐藥基礎(chǔ)上產(chǎn)生的，是量變到質(zhì)變的過程，可能是耐藥菌耐藥基因進一步變異的結(jié)果［10］。本研究結(jié)果表明，RFP依賴株和耐藥株在rpoB基因突變位點上略有不同，但因檢測的樣本量有限，僅檢測了19例，不足以說明兩者之間是否差異有統(tǒng)計學(xué)意義，因此，需要進一步擴大樣本量，以鑒定RFP依賴株和耐藥株的差異。其他研究也表明，結(jié)核分枝桿菌RFP依賴株和耐藥株的rpoB基因突變位點基本相同，DNA指紋類型及分布亦無明顯特殊性，表明前者的變異主要為表型變異［18］。因此，依賴現(xiàn)象的獨特表現(xiàn)可能源于基因表達差異。

綜上所述，RFP依賴菌在臨床RFP耐藥株中的檢出率高，并在小鼠體內(nèi)初步觀察到體外RFP依賴菌株的RFP依賴現(xiàn)象。但由于本研究主要以肉眼觀察指標(biāo)來判斷藥物依賴，沒有量化指標(biāo)，所以研究結(jié)果也存在一定的局限性。同時，通過對利福平依賴與非依賴菌株中MDR及XDR菌株進行測序分析，檢測突變位點，發(fā)現(xiàn)RFP耐藥株和依賴株的rpoB基因突變位點基本相同，因此RFP依賴的原因是表型變異還是其他因素尚有待進一步的實驗證實。

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