劉國慶，趙鵬偉，溫建新，劉 坤

（1.膠南市動物疾病控制中心，山東青島 266400；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；3.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

近年來，水貂等小型毛皮動物消化道菌群的研究已成為一個重要的新課題，但是，目前國內(nèi)對水貂腸道菌群的研究未見報(bào)道。為了進(jìn)一步研究腸道有益菌對動物機(jī)體的影響。其中，乳酸菌作為動物腸道中的優(yōu)勢菌群之一，其對動物的有益作用已被許多研究結(jié)果所證實(shí)[1]。因此，我們采用水貂糞便，分離純化乳酸桿菌，利用生化試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，從而確定水貂消化道中的優(yōu)勢乳酸桿菌的種屬及數(shù)量、耐酸試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)等，為水貂飼料的乳酸桿菌添加劑的開發(fā)，提高水貂的健康水平和經(jīng)濟(jì)效益都有極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 糞便來自成年丹麥紅眼母貂，并分別標(biāo)記為1號、2號、3號，放入滅菌的平板密封置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、五糖發(fā)酵管（葡、麥、蔗、乳、甘）、H2S、靛基質(zhì)、MR試劑、VP試劑、吲哚試劑、葡萄糖蛋白胨水、三糖鐵培養(yǎng)基、藥敏紙片（購自杭州天和微生物試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與處理 取糞便樣品1號、2號、3號各2 g，分別置于含生理鹽水198 mL錐形瓶，制成10-2梯度稀釋液。振蕩混勻30 min，制成勻漿后，靜置15 min。依次制成梯度為10-2，10-3，10-4，10-5四個梯度的樣品稀釋液。

1.2.2 分離純化 取樣品的稀釋液100 μL于MRS培養(yǎng)基上，厭氧37 ℃培養(yǎng)2~3天。挑取典型菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。疑似陽性的菌落接種到莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。

1.2.3 生化試驗(yàn)鑒定 挑取染色為陽性的無分叉菌落，按照常規(guī)的方法進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)，KOH試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、三糖鐵穿刺試驗(yàn)；糖發(fā)酵試驗(yàn)[2]、MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)。

1.2.4 耐酸試驗(yàn) 用營養(yǎng)肉湯將乳酸桿菌制成菌懸液。然后調(diào)節(jié)營養(yǎng)肉湯pH值為5.0、4.0、3.0、2.0，分別裝入試管中，每管裝4 mL。將菌株液體培養(yǎng)物10 μL接入到不同pH值的營養(yǎng)肉湯中，37 ℃厭氧培養(yǎng)18h，判定菌株生長情況。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 將乳酸菌懸液取100 ul涂布于MRS培養(yǎng)基上，用滅菌的鑷子將藥敏片貼到培養(yǎng)基表面，輕輕壓實(shí)。將培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)24 h，測定藥敏圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果 分離出4株鏡檢為革蘭氏陽性的桿菌，分別命名為A1，A2，A3，A4。菌落形態(tài)多為中央凸起、邊緣整齊、黃色或白色半透明狀菌落約0.5~3 mm之間。分離株乳酸菌細(xì)胞形態(tài)有長桿、短桿，多數(shù)呈鏈條狀排列。

2.2 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

試驗(yàn)分離到的4株革蘭氏陽性桿菌能夠在pH4.5的營養(yǎng)肉湯中生長。其次過氧化氫酶試驗(yàn)，KOH試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、三糖鐵穿刺試驗(yàn)，皆為陰性，初步鑒定為乳酸桿菌屬（L.actobacillus）。

4株菌株的MR試驗(yàn)均為陰性，VP試驗(yàn)均為陽性。A1，A2，A3菌株對七葉靈、果糖、乳糖、麥芽糖和蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)均為陽性，甘露醇和山梨糖發(fā)酵試驗(yàn)為陰性，A1和A3菌株對葡萄糖和甘露糖試驗(yàn)結(jié)果不明顯。A2菌株棉籽糖測定結(jié)果不明顯。綜上，可將A1，A2，A3菌株鑒定為嗜酸性乳酸桿菌（L.acidophilus）。A4株對七葉靈、果糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨糖和蔗糖試驗(yàn)均顯陽性，甘露糖和棉籽糖試驗(yàn)顯陰性，綜上，可將A4菌株基本鑒定為干酪乳酸桿菌（L.casei）。

2.3 耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)生化鑒定結(jié)果，選擇A1和A4兩種菌株進(jìn)行不同pH值生長情況試驗(yàn)。判定試驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液基底部是否有白色沉淀，如果有白色沉淀，搖動呈渾濁狀，說明菌株在此培養(yǎng)條件下能夠進(jìn)行繁殖生長。結(jié)果表明，pH值在2.0和3.0，培養(yǎng)效果基本相同，在培養(yǎng)液底部的白色沉淀比較少，說明菌株在此pH不能生長。但是當(dāng)pH值上升到4.0時，兩種菌株的培養(yǎng)液底部都有一定程度的白色沉淀，而且A1菌株沉淀最多，說明其在pH為4.0左右時適宜生長。當(dāng)pH為5.0時，A1，A4菌株的培養(yǎng)液底部也有沉淀。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

用標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923（S.aureus ATCC25923）作為質(zhì)控菌，試驗(yàn)菌對抗生素的藥敏性參照WHO提供的NCCLS的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。對A1和A4菌株進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，得到A1和A4菌株對8種抗生素的藥敏結(jié)果。通過試驗(yàn)結(jié)果可以看出，A1菌株對青霉素、慶大霉素、氨芐西林和氯霉素有一定的耐藥性，其中對青霉素和氨芐西林的耐藥性較強(qiáng)，而對其余的幾種抗生素則表現(xiàn)為敏感；A4菌株對青霉素、氨芐西林和環(huán)丙沙星表現(xiàn)了耐藥性，其中對青霉素和環(huán)丙沙星的耐藥性較強(qiáng)，對其余的幾種抗生素則表現(xiàn)為敏感。

3 討論

3.1 菌種鑒定方法的討論

近些年來，隨著技術(shù)的發(fā)展，基因鑒定方法流行起來，基因鑒定主要是通過PCR技術(shù)對乳酸桿菌產(chǎn)物的分析檢測，以獲得基因組DNA在待測區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性進(jìn)行鑒別。通過試驗(yàn)我們可以發(fā)現(xiàn)，各種乳酸桿菌在表型上十分相似，用傳統(tǒng)的生化試驗(yàn)進(jìn)行分離，的確造成了一定的困難。日本的M.Sami和Y.Tsuchiya等已在PCR法檢測乳酸桿菌方面做了一些研究[3-4]，因此期望在此基礎(chǔ)上能探索出一種快速、高效、準(zhǔn)確的方法來鑒定乳酸桿菌。

3.2 耐酸性試驗(yàn)的討論

耐酸性試驗(yàn)的目的是研究乳酸桿菌在不同pH值的生長情況。動物胃中的pH值為2.0~6.0，口服是益生菌進(jìn)入腸道的主要途徑，因此，益生菌株必須有良好的耐酸能力，才能通過高酸性的胃環(huán)境到達(dá)腸道發(fā)揮能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸桿菌A1和A4具有比較強(qiáng)的耐酸性，這與李太元等[5]的報(bào)道結(jié)果相符。因此，A1和A4這2種菌株完全能適應(yīng)動物胃腸道環(huán)境，作為微生態(tài)制劑用菌種具有良好的潛力。

3.3 藥敏試驗(yàn)討論

從實(shí)驗(yàn)中可以看出，A1菌株嗜酸性乳酸桿菌對于先鋒V、克林霉素、紅霉素、阿米卡星比較敏感，對于青霉素、慶大霉素、氨芐西林以及氯霉素表現(xiàn)出了不同程度的耐藥性。而A4菌株干酪乳酸桿菌對于慶大霉素、先鋒V、紅霉素、阿米卡星以及克林霉素比較敏感，對于青霉素、氨芐西林以及環(huán)丙沙星有一定的耐藥性。李平蘭[6]研究了微生態(tài)制劑生產(chǎn)中常見的幾種乳酸菌對8大類30種常用抗生素的藥敏性。結(jié)果顯示，桿菌對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類及氯霉素敏感，對氨基糖苷類多數(shù)表現(xiàn)出耐藥，對頭孢素類、青霉素類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合物、糖肽類抗生素表現(xiàn)出不同的藥敏性，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合。曹國文[7]的試驗(yàn)結(jié)果中，6株豬源乳酸桿菌對青霉素全部耐藥，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與之相符合。

通過實(shí)驗(yàn)，得知分離到的兩株乳酸桿菌對于青霉素、氨芐西林等抗生素都產(chǎn)生耐藥性。這些問題提醒我們在以后的獸醫(yī)臨床上，應(yīng)盡量減少對于有耐藥性或者耐藥率較高的抗生素的使用，選用一些沒有出現(xiàn)耐藥性的抗生素，可以達(dá)到更好治愈疾病的目的[8]；同時，還可以為乳酸桿菌型微生態(tài)的制劑的使用提供必要的參考依據(jù)。

[1] 惠恩舉.發(fā)展水貂生產(chǎn)市場潛力大前景好[J].特種經(jīng)濟(jì)動植物，2005（5）：3-4.

[2] 姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版，2002：36-39.

[3] Gill H S. Stimulation of the immune system by lactic cultures[J]. Int Dariy J，1998 （8）：535-534.

[4] Cotter P D，Hill C. Surviving the Acid Test：Responese of Gram-Positive Bacteria to Low pH[J]. Microbiol Mol Biol Rev，2003，67 （3）：429-453.

[5] 李太元，劉偉銘，金鑫，許廣波，等.健康犬腸道乳酸桿菌某些生物學(xué)特性的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27 （6）：667-670.

[6] 李平蘭，潘偉好，呂艷妮，等.微生態(tài)制劑中常用乳酸菌對抗生素的藥敏性研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，9（1）：16-20.

[7] 曹國文，姜永康，戴榮國，等.6株豬源乳酸桿菌的分離鑒定與生物學(xué)特性研究[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2006，（3）：23-24.

[8] 高榮琨，王昕，李文斌，乳酸菌對雞免疫功能的影響[J].中國動物檢疫，2009，26（9）：39-40.