肖光文，劉良專，徐 磊，謝小平，3，吳移謀

肺炎嗜衣原體（Chlamydophilapneumoniae，Cpn）除引起呼吸道疾病外，還與一些其他疾病如結(jié)節(jié)性紅斑、Guillian－Barré綜合征、結(jié)節(jié)病、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎［1］以及慢性動(dòng)脈粥樣硬化［2－3］等疾病有關(guān)。Cpn致病機(jī)制的研究多年來(lái)一直是衣原體研究的熱點(diǎn)之一。

有研究證實(shí)，在Cpn中存在獨(dú)立的能分泌毒力因子的細(xì)胞器［4］——III型分泌系統(tǒng)（Type III se－cretion system，T3SS）。T3SS由30～40kbp基因編碼，以毒力島的形式存在于細(xì)菌的質(zhì)?；蛉旧w上，其主要作用是通過接觸依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制將效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞（真核細(xì)胞）中，從而影響宿主細(xì)胞的正常新陳代謝及其功能［5］。

Robert等用非線性pH3－10的預(yù)制金條進(jìn)行二維電泳證實(shí)了Cpn0425存在于Cpn蛋白簇中。其基因由588個(gè)堿基構(gòu)成，分子量大約為21．3kD，目前功能不明。許多研究者認(rèn)為編碼T3SS效應(yīng)蛋白的基因通常位于其伴侶蛋白的附近［6］，Cpn0425位于編碼T3SS的基因族內(nèi)，因此將其預(yù)測(cè)為CpnT3SS的一個(gè)效應(yīng)蛋白。本研究主要通過從Gen－Bank中得到Cpn0425編碼基因的堿基序列，對(duì)照pGEX6p－2載體上的多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性擴(kuò)增引物。對(duì)該蛋白進(jìn)行體外的克隆表達(dá)及純化，為CpnT3SS效應(yīng)蛋白的篩選與鑒定及其致病作用的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 菌株、重組質(zhì)粒和細(xì)胞株 pGEX6p－2質(zhì)粒，E．coliBL21菌株：均為南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存。

1．2 工具酶、分子量標(biāo)準(zhǔn)、試劑盒 Tag酶、T4連接酶、BamHⅠ、NotⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司；次高分子量蛋白Marker購(gòu)自北京MBI公司；1kbp和100bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自美國(guó)MBI公司；AxyPrep PCR試劑盒購(gòu)自Axygen公司；GST純化樹脂購(gòu)自默克Novagen。

1．3Cpn0425基因的擴(kuò)增Cpn0425基因全長(zhǎng)序列通過互聯(lián)網(wǎng)從GenBank獲得，對(duì)照pQE30載體上的多克隆酶切位點(diǎn)，采用Primer Premier 5．0軟件設(shè)計(jì)Cpn0425基因的特異性擴(kuò)增引物。分別在上游引物（P1）和下游引物（P2）中引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)核苷酸G▼GATCC和NotI酶切位點(diǎn)核苷酸GC▼G G CCGC，同時(shí)加上保護(hù)性堿基。引物由武漢Invitrogen公司合成，上游引物：5′－CGC G▼GATCCATG AAT AAA AAG CCC AAG AAA AC－3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物：5′－TTTTCCTTTT GC▼G G CCGC TTA CTC AGC GCC TTT AAC CAT －3′（下劃線為NotⅠ酶切位點(diǎn)），以CpnAR－39標(biāo)準(zhǔn)株的基因組DNA為模板。用PyrbestTMDNA高保真聚合酶（TaKa－Ra公司產(chǎn)品）進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系：10×buffer（含 MgCl2）5μL、2．5mmol／LdNTP 4μL、50fmol／L 引物各0．5μL、PyrbestTMDNA polymerase（5U）0．25μL、DNA模板1μL，加水至總體積為50μL。擴(kuò)增參數(shù)：混勻后點(diǎn)離，94℃預(yù)變性5min后，進(jìn)入94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸60s的循環(huán)，共計(jì)30次，末次循環(huán)后72℃延伸10min，終止反應(yīng)。

1．4 pGEX6p－2／Cpn0425原核表達(dá)載體的構(gòu)建采用Axygen公司的AxyPrep PCR試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化的PCR產(chǎn)物（Cpn0425基因）與克隆載體pGEX6p－2在T4DNA連接酶的作用下，16℃連接過夜，克隆重組體pGEX6p－2／Cpn0425轉(zhuǎn)入感受態(tài)E．coliBL21，增菌后，氨芐青霉素和藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，提取重組體質(zhì)粒，PCR及BamHⅠ和NotⅠ（美國(guó)Promega公司）雙酶切鑒定重組情況。

1．5 核苷酸序列測(cè)定 將連接成功的陽(yáng)性克隆pGEX6p－2／Cpn0425菌液（E．coliBL21）送上海生工進(jìn)行目的基因測(cè)序，序列測(cè)定結(jié)果與GenBank上發(fā)表的CpnAR－39Cpn0425序列進(jìn)行Blast比較，以判斷目的片段是否連接成功。

1．6Cpn0425在E．coli中的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 取重組質(zhì)粒pGEX6p－2／Cpn0425E．coliBL21轉(zhuǎn)化菌10μL，將菌液加到LB固體培養(yǎng)基（含氨節(jié)青霉素）上，用接種環(huán)劃平板，37℃培養(yǎng)14h，挑取1個(gè)陽(yáng)性菌落，加入2mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃水浴振蕩培養(yǎng)過夜；次日以1∶50的比例接種于5mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，重組菌培養(yǎng)至OD值為0．6左右時(shí)，向培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0．2mmol／L，30℃分別誘導(dǎo)表達(dá)4h；取1．0mL菌液13 000r／min離心30s，收集菌體沉淀，分別用100μL 2×SDS凝膠加樣緩沖液重懸，然后100℃水浴中加熱5min，13 000r／min離心5min，留上清作SDS－PAGE分析。

1．7Cpn0425純化 按照上述條件進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，10 000r／min離心20min收獲菌體沉淀。PBS洗滌沉淀，重懸于PBS中（每克濕菌體加8mL PBS），并加入溶菌酶至4．0g／L；室溫孵育2h，超聲裂菌（10s／次，間歇10s；共計(jì)30次）。10 000r／min離心20min分別收集上清和沉淀。取超聲裂菌上清，采用默克Novagen的GST純化樹脂按說(shuō)明純化pGEX6P－2／Cpn0425重組表達(dá)產(chǎn)物 GSTCpn0425，分別收集過柱液以及各段洗滌、洗脫液，取樣進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析。合并洗脫液，用tris8．0將目的蛋白透析2～3次，換蒸餾水透析1～2次，再回收透析袋里的液體。

1．8Cpn0425蛋白的鑒定 純化產(chǎn)物經(jīng)SDS－PAGE電泳后轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，用TBST 1：200稀釋的鼠抗CpnAR－39多克隆抗體為一抗，1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行Western－Blot鑒定，鑒定其抗原性。

2 結(jié) 果

2．1 pGEX6p－2／Cpn0425的 PCR 擴(kuò)增 將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1．0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，在約590bp左右位置可見一條清晰的特異性條帶（圖1），與預(yù)期片段大?。?88bp）相符。

圖1 pGEX6p－2／Cpn0425質(zhì)粒PCR鑒定Fig．1 PCR analysis of pGEX6p－2／Cpn0425plasmidM：DNA marker；1：PCR product of PGEX6p－2／Cpn0425

2．2 pGEX6p－2／Cpn0425原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 構(gòu)建的pGEX6p－2／Cpn0425重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析可見，酶切后出現(xiàn)了兩個(gè)片段，大片段接近4 900bp，小片段約590bp左右與預(yù)期值（588bp）相符（圖2）；初步證明Cpn0425目的基因成功地嵌入pGEX6p－2載體中。

圖2 pGEX6p－2／Cpn0425質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig．2 Restriction enzyme digest analysis of pGEX6p－2／Cpn0425plasmid1：PGEX6p／Cpn0425plasmid digested by BamHI and XhoⅠ；2：PGEX6p／Cpn0425recombinant plasmid；M：15 000bp DNA marker

2．3 核苷酸序列分析Blast分析 將重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，BLAST軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與GenBank上登錄的編碼序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明擴(kuò)增的Cpn0425目的基因序列與登錄號(hào)為gi 15617929上基因完全一致，無(wú)堿基突變，且密碼子讀碼框架正確。

pGEX6p－2／Cpn0425重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)與純化及其鑒定 將pGEX6p－2／Cpn0425重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E．coliBl21表達(dá)宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDSPAGE結(jié)果顯示：誘導(dǎo)菌在Mr約為50kDa處有明顯條帶，與預(yù)期的分子量相符。GST－Cpn0425重組蛋白上GST融合蛋白純化柱，12%SDS－PAGE分析發(fā)現(xiàn)，緩沖液Ⅰ，Ⅱ，III洗脫下少量目的蛋白，洗脫液在相應(yīng)位置最終收集得到純化融合蛋白，其Mr約為50kDa。融合蛋白下可見一些條帶，考慮為融合蛋白降解產(chǎn)物形成，見圖3。

圖3 GST－Cpn0425純化的SDS－PAGE結(jié)果Fig．3 SDS－PAGE of purified GST－Cpn0425M：Protein marker；1：Precipitation of broken induced Bl21with pGEX6p－2／Cpn0425；2：Supernatant of broken induced Bl21with pGEX6p－2／Cpn0425；3：Flow－through；4－6：Washes；7－9：Eluates（Purified GST－Cpn0425）

2．4 GST－Cpn0425重組蛋白的 Western blot鑒定以鼠抗CpnAR－39多克隆抗體為一抗，Western blot檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)的GST－Cpn0425，結(jié)果表明在Mr約為50kDa處出現(xiàn)了明顯的特異性反應(yīng)條帶，而未誘導(dǎo)的菌體無(wú)特異性條帶出現(xiàn)，見圖4。

圖4 GST－Cpn0425的免疫印跡鑒定Fig．4 Western blot analysis of the GST－Cpn0425recombinant protein1：Induced Bl21with pGEX6p－2／Cpn0425；2：Noninduced Bl21with pGEX6p－2／Cpn0425；3：Purified GST－Cpn0425recombinant protein

3 討 論

本研究選擇的pGEX6p－2表達(dá)載體，是經(jīng)pBR322質(zhì)粒改造而來(lái)的一種原核表達(dá)載體，采用乳糖操縱子調(diào)控模式，啟動(dòng)子是Ptac，使mRNA轉(zhuǎn)錄水平提高，可以誘導(dǎo)外源基因在宿主菌中高效表達(dá)。它含有供目的基因插入的多克隆位點(diǎn)，并攜帶氨芐青霉素β－內(nèi)酰胺酶抗性基因，有利于轉(zhuǎn)化宿主菌后篩選陽(yáng)性克?。煌瑫r(shí)含有GST的編碼序列，可使表達(dá)的外源重組蛋白融合入一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量約26×103的GST純化標(biāo)簽，該標(biāo)簽對(duì)表達(dá)蛋白的有效純化和保持蛋白質(zhì)的天然生物學(xué)活性作用重大。對(duì)GST融合蛋白采用默克Novagen的GST純化樹脂進(jìn)行純化，GST純化填料的專一性非常高，只對(duì)GST及其融合蛋白具有吸附活性，有利于提高目標(biāo)蛋白的純度；同時(shí)利用GST與GSH的親和作用來(lái)純化蛋白，只有GST天然蛋白才具有該親和特性，因此得到的純化蛋白能夠保持其天然的生物學(xué)活性。本研究中我們選擇pGEX6p－2作為原核表達(dá)載體，高效表達(dá)了GST融合蛋白，有效純化的GST融合蛋白不但純度高而且具有天然生物學(xué)活性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性奠定良好的基礎(chǔ)。

本研究選擇的表達(dá)菌E．coliBL21是常用的表達(dá)菌株，一般配合以強(qiáng)表達(dá)載體pGEX載體來(lái)進(jìn)行目的基因的強(qiáng)表達(dá)。由于BL21菌株缺失Lon和OmpT蛋白酶產(chǎn)物，這可以降低宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白酶降解的影響。此外還可以幫助提高完整可溶性蛋白的產(chǎn)率。為高效表達(dá)可溶性GST融合蛋白提供良好條件。

用PCR法從CpnAR－39基因組模板中擴(kuò)增出目的片段，經(jīng)測(cè)序證實(shí)與基因庫(kù)登陸的核苷酸序列一致，將目的基因亞克隆到原核表達(dá)載體構(gòu)建了表達(dá)重組體pGEX6p－2／Cpn0425，并成功轉(zhuǎn)化至E．coliBL21。重組蛋白可以充分結(jié)合在默克Novagen的GST純化樹脂柱上，經(jīng)純化得到高純度的目的蛋白。本研究還對(duì)重組融合蛋白進(jìn)行了透析處理，蛋白透析可降低谷光甘肽（GST）的濃度，因而進(jìn)一步優(yōu)化了本研究的條件。此外，蛋白免疫印跡進(jìn)一步分析了表達(dá)的重組蛋白及純化蛋白的免疫特性，重組蛋白能與鼠抗CpnAR－39多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明了目的蛋白能在大腸桿菌中表達(dá)，并具有很好的抗原性。

目前CpnT3SS效應(yīng)蛋白的相關(guān)研究已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，其效應(yīng)蛋白的鑒定及致病作用的研究已經(jīng)取得了一些成果，支持性的證據(jù)［4］包括與其它細(xì)菌T3SS效應(yīng)蛋白有相似的直接序列或二級(jí)結(jié)構(gòu)；與其它T3SS同源體接合或共沉淀；T3SS介導(dǎo)的分泌物的論證或目的效應(yīng)蛋白通過一個(gè)替代宿主細(xì)菌T3SS分泌 。有資料表明，效應(yīng)蛋白包含多種毒性效應(yīng)，包括細(xì)胞骨架的改變、破壞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和抑制凋亡活性以及干擾宿主轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等［7］。Cpn0425是一個(gè)目前尚未知功能的蛋白，其基因位于T3SS伴侶蛋白附近。研究其生物學(xué)作用及其在致病過程中的作用對(duì)了解其是否和Cpn致病有關(guān)及篩選、鑒定其是否屬于CpnT3SS效應(yīng)蛋白奠定基礎(chǔ)。

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